電脈沖介導(dǎo)的基因治療影響兔髂骨貼附移植成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分電脈沖介導(dǎo)的pIRES-hVEGF165-EGFP對(duì)兔髂骨貼附移植植骨過程中早期血管生成的影響
　　 目的:探討電脈沖介導(dǎo)的pIRES-hVEGF165-EGFP體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的可行性以及對(duì)兔下頜骨髂骨貼附移植植骨過程中早期血管生成的影響。
　　 方法:48只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組，A組:pIRES-hVEGF165-EGFP+電穿孔組，B組:pIRES-hVEGF165-EGFP注射組，C組:生理鹽水+電穿孔組

2、。取兔自體髂骨貼附移植于下頜骨后，按組別在移植骨周圍分別注射重組質(zhì)粒pIRES-hVEGF165-EGFP(A、B組)和生理鹽水（C組），A、C組術(shù)后即時(shí)施加電刺激，B組不施加電刺激。術(shù)后3、7、14、21d切取組織，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)，檢測(cè)外源基因的表達(dá):取心、肝、腎組織學(xué)HE染色，取右心血檢測(cè)肝、腎功能(ALT、AST、BUN、Scr);免疫組化法檢測(cè)移植骨血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、CD34蛋白的表達(dá)，并對(duì)

3、CD34表達(dá)陽性血管進(jìn)行微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)，對(duì)VEGF蛋白表達(dá)和MVD計(jì)數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:三組兔血清中的ALT、AST、BUN、Scr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.017)，A組心、肝、腎組織學(xué)染色顯示各器官組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞正常，無變性、壞死。熒光顯微鏡下觀測(cè)GFP示A組3d時(shí)可見明顯綠色熒光蛋白表達(dá)，7d達(dá)到高峰，14d表達(dá)漸弱于7d，21d明顯減弱，但仍可以觀察到熒光;各時(shí)間點(diǎn)GFP表達(dá)明顯強(qiáng)于B組，C組未

4、見GFP表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示各組VEGF陽性表達(dá)于新生小血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中，VEGF蛋白分布范圍與染色強(qiáng)度以A組最明顯，各時(shí)間點(diǎn)VEGF灰度值A(chǔ)組與B、C組之間有顯著性差異(P＜0.017)，B組、C組之間無顯著性差異(P＞0.05)，A組各時(shí)間點(diǎn)VEGF蛋白含量明顯高于B、C組。按照CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)計(jì)算微血管密度(MVD)顯示A組MVD明顯高于B、C組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.017);B、C組

5、間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)三組VEGF蛋白表達(dá)與MVD之間均成正相關(guān)(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:1.電脈沖介導(dǎo)的重組質(zhì)粒pIRES-hVEGF165-EGFP體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染安全可行。
　　 2.轉(zhuǎn)染VEGF可以促進(jìn)兔下頜骨髂骨貼附移植早期再血管化。
　　 第二部分電脈沖介導(dǎo)的pIRES-hVEGF165-EGFP對(duì)兔髂骨貼附移植成骨作用的影響
　　 目的:探討電脈沖介導(dǎo)的pIRES

6、-hVEGF165-EGFP體內(nèi)基岡轉(zhuǎn)染對(duì)兔下頜骨髂骨貼附移植骨成骨能力的影響。
　　 方法:60只新西蘭大白兔，隨機(jī)分為3組，A組:pIRES-hVEGF165-EGFP+電穿孔組，B組:pIRES-hVEGF165-EGFP注射組，C組:生理鹽水+電穿孔組。取兔自體髂骨貼附移植于下頜骨后，按組別在移植骨周圍分別注射重組質(zhì)pIRES-hVEGF165-EGFP（A、B組）和生理鹽水（C組），A、C組術(shù)后即時(shí)施加電刺激，B組不施

7、加電刺激。于術(shù)后第3、7、14、21、70d將移植骨連同宿主骨一同切取，大體觀察移植骨成活情況，并通過HE染色和免疫組化檢測(cè)第3、7、14、21、70d的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)、Ⅰ型膠原(COL-Ⅰ)的表達(dá)，比較各組間的表達(dá)差異，檢查移植骨改建情況，同時(shí)用排水法測(cè)量移植骨術(shù)前和術(shù)后70d的體積，計(jì)算移植骨吸收率。
　　 結(jié)果:術(shù)后70d各組移植骨與宿主骨之間完全融合，移植骨在三維方向上均

8、有吸收，A組骨塊體積明顯大于B、C組;A、B、C三組移植骨的吸收率分別為55.25％、62.38％和64.25％。HE染色顯示術(shù)后70d各組移植骨完全成活，未見死骨及吸收后空泡，未見破骨細(xì)胞，A組移植骨與宿主骨交界面骨性連接較B、C組明顯，未見明顯纖維連接。各組VEGF、OC、OPN、COL-Ⅰ免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行灰度值檢測(cè)及分析顯示，7d、14d及21d時(shí)，A組VEGF蛋白表達(dá)與B、C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;21d時(shí)，A組OC蛋白表達(dá)與B