腺病毒介導(dǎo)的人干擾素γ基因治療胰腺癌的實驗研究.pdf

1、[背景和目的]
　　胰腺癌(Pancreatic carcinoma)是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來,在世界范圍內(nèi),其發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢。在歐美等工業(yè)發(fā)達國家,胰腺癌已是死亡率高居第4位的常見惡性腫瘤,而在我國由于人口老齡化、生活和飲食習慣的改變、環(huán)境污染等諸多原因,我國胰腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)上升的趨勢。腫瘤的常規(guī)治療方式有手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療。但由于該病發(fā)病部位隱蔽、早期無特異性體征、高度的侵襲性和進展性,大多

2、數(shù)患者在確診時已達局部晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,而且即使是早期發(fā)現(xiàn)、早期實施切除手術(shù)的原發(fā)腫瘤患者,相當一部分也會由于手術(shù)切除不徹底而發(fā)生局部復(fù)發(fā)或手術(shù)切除前已經(jīng)出現(xiàn)了微轉(zhuǎn)移。2007年美國預(yù)期有37,170新發(fā)病患者,估計其死亡人數(shù)與發(fā)病人數(shù)相當(33,370),即絕大部分的患者在確診不到一年的時間內(nèi)死去。目前,針對已經(jīng)轉(zhuǎn)移的晚期患者的常規(guī)治療手段是化療,而作為全身治療方式的化學(xué)治療,無論從毒副作用、病人生活質(zhì)量、生存期來看,效果都不盡如人

3、意。考慮到該病發(fā)病的普遍性和高死亡率,因此,探索新的、有效的預(yù)防及治療方法顯得十分迫切。
　　無論是許多臨床前細胞、動物模型研究,還是臨床實驗研究,均已證實干擾素-γ(IFNγ)具有直接抑制腫瘤細胞的增殖、免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤血管生成等諸多抗癌活性。但是由于靜脈注射重組IFNγ蛋白的體內(nèi)半衰期短(僅幾分鐘),大劑量反復(fù)給藥系統(tǒng)毒性大,因此限制了其臨床應(yīng)用。
　　腫瘤生物治療(Biotherapy)包括免疫治療和基因治療,是上世

4、紀80年代發(fā)展起來的建立在“改變宿主對腫瘤細胞的生物學(xué)反應(yīng)而起到抗腫瘤的效果”。這種方法挾現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫學(xué)迅猛發(fā)展之勢,已被認為是繼腫瘤外科、放療、化療三大常規(guī)治療方式之后腫瘤綜合治療中的第四種模式,越來越受到重視。
　　本研究采用重組的腺病毒作為基因治療的載體,利用病毒感染腫瘤細胞使目的基因人干擾素γ基因?qū)肽[瘤細胞,通過借助腫瘤細胞的蛋白合成系統(tǒng),將腫瘤細胞作為藥物合成的“工廠”持續(xù)合成分泌具有治療作用的IFNγ,可以避

5、免靜脈注射重組蛋白的半衰期短、反復(fù)給藥、毒副作用大等缺點,從而達到更好的治療效果。除了探討攜帶 IFNγ的腺病毒(Ad- IFNγ)在胰腺癌中的治療作用,還初步研究其可能的作用機制,并檢測其與近年來治療胰腺癌的一線藥物吉西他濱(gemcitabine)聯(lián)合用藥是否存在疊加或協(xié)同的治療效果。
　　[材料和方法]
　　利用HEK293細胞擴增攜帶IFNγ的腺病毒,通過氯化銫密度梯度純化病毒,以PCR鑒定純化的腺病毒,確定其含治療

6、基因、無野生型腺病毒(wt-Ad)、腺相關(guān)病毒(AAV)污染后,感染體外培養(yǎng)胰腺癌細胞株 Capan-2,體外不同時間檢測基因蛋白表達情況以及抗增殖效果、對細胞凋亡的影響;通過建立裸鼠皮下移植瘤模型,檢測瘤內(nèi)注射抑瘤效果,并通過ELISA檢測荷瘤小鼠IFNγ組織動態(tài)分布情況、RT-PCR半定量檢測腫瘤組織中IFNγ基因表達、取腫瘤組織切片進行 HE染色、免疫組化檢測組織細胞增殖(Ki-67)、評價組織的凋亡(TUNEL)情況。
　

7、　[結(jié)果]
　　Ad- IFNγ感染細胞后能高效持續(xù)表達蛋白IFNγ,抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡。體內(nèi)實驗表明:瘤內(nèi)注射重組腺病毒可以抑制腫瘤生長;RT-PCR從轉(zhuǎn)錄水平、ELISA從蛋白水平證明治療基因產(chǎn)物IFNγ可以在腫瘤組織持續(xù)表達高達一周。酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測顯示基因產(chǎn)物IFNγ主要分布在腫瘤組織中,其次是肝臟和血液中而其它臟器分布較少,在治療過程中小鼠未見明顯的系統(tǒng)毒副作用;Ad-IFNγ處理組小鼠的移植腫瘤與

8、對照組相比明顯小于對照組(PBS組和Ad-LacZ組),與Ad-LacZ組相比抑瘤率為42.56％±8.50%,而和PBS組相比抑瘤率為47.80%±8.96%。組織切片HE染色證明注射Ad- IFNγ的腫瘤組織壞死明顯;免疫組化檢測Ki-67,發(fā)現(xiàn)治療組腫瘤的Ki-67表達減少,而TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)治療組與對照組相比凋亡明顯(P<0.05)。小鼠體內(nèi)荷瘤實驗表明,注射Ad-IFNγ與低濃度的化療藥聯(lián)合應(yīng)用可以增強抗腫瘤的效果,同時避免