蛋白酶體抑制劑MG-132對大鼠骨骼肌成肌調(diào)節(jié)因子MyoD基因表達的影響.pdf

1、目的：探討蛋白酶體抑制劑MG-132對大鼠骨骼肌成肌調(diào)節(jié)因子(MyoD)基因表達的影響。 方法：選擇健康的雄性SD大鼠72只，體重195±5g，隨機分成3組，即A組：空白對照組、B組：去神經(jīng)組、C組：去神經(jīng)MG-132干預(yù)組，每組24只。A組不做處理；B組和C組全部制作成標(biāo)準(zhǔn)的右側(cè)坐骨神經(jīng)離斷，腓腸肌失神經(jīng)支配模型，并在C組大鼠失神經(jīng)腓腸肌局部多點注射濃度為20μmol/L的蛋白酶體抑制劑MG-132100μL，1次/d。分別于

2、去神經(jīng)第2d、7d、14d、28d，用脊椎脫臼法處死大鼠，解剖并分離出右小腿的腓腸肌，切取的肌肉樣本快速置于-70℃冰箱凍存，留待28天后統(tǒng)一檢測。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測MyoD mRNA的表達變化，以GAPDH作為內(nèi)參照，做半定量檢測。取樣本組織50mg勻漿后用抽提試劑進行總RNA抽提，然后用MBI公司的RT-PCR試劑盒，按樣本RNA2μg，20μl體系進行反轉(zhuǎn)錄。MyoD的引物通過primer5.0引物設(shè)計

3、軟件設(shè)計，片斷長度為137bp；作為內(nèi)參照的GAPDH的引物由山西醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供，片斷長度為307bp。聚合酶鏈反應(yīng)按50μl體系，反應(yīng)條件為：94℃，2′，lcycle。94℃，30″；Tm(MyoD53℃)/(GAPDH50℃)，30″；72℃，2′，36 cycle。用瓊脂糖凝膠水平電泳，電壓采用160v，電泳約1h，然后用凝膠成像儀獲取圖像。用免疫印跡法(Westernblot法)測定MyoD的蛋白質(zhì)表達的變化：用β-ac

4、tin作為內(nèi)參照，做半定量檢測。取樣本組織100mg勻漿后用普利萊蛋白提取試劑盒進行總蛋白抽提，煮沸、離心后，加樣于垂直電泳槽行SDS-PAGE，電泳約3小時，轉(zhuǎn)膜1小時30分鐘，封閉室溫4小時，孵育一抗(Ab1)4℃過夜，漂沈后孵育二抗(Ab2)4℃約4小時，TBS漂洗后，置于暗室加ECL發(fā)光試劑盒反應(yīng)，一分鐘左右立即放在暗箱曝光，60秒左右取出浸入顯影劑內(nèi)，觀察至最佳顯影后，撈出在清水中洗凈，然后置于定影劑中15分鐘，取出晾干后用數(shù)

5、碼相機獲取圖片。最后用Photoshop圖像軟件獲取數(shù)據(jù)，用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果：(1)B組和C組MyoD的mRNA和蛋白含量在去神經(jīng)支配后第2d、7d、14d、28d均表達上調(diào)與A組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；(2)B組與C組的MyoDmRNA和蛋白含量在去神經(jīng)支配后第2d、7d、14d、28d的比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；(3)大鼠骨骼肌失神經(jīng)支配早期，失神經(jīng)的時間和失神經(jīng)后的干預(yù)因素相互作用