Real-time PCR檢測水體日本血吸蟲尾蚴和小鼠感染早期檢測的研究.pdf

1、目的：(1)比較日本血吸蟲DNA重復序列psjrh1．0(U92488．1)、18S小亞基單位核糖體核酸基因(18SrRNA)序列(AY157226．1)和sjR2的G55A聲隆(AF412221．1)在基因組中的豐度，初步確定SYBR GreenⅠ熒光實時定量PCR(RQ—PCR)方法檢測日本血吸蟲的較適宜靶基因和反應條件。(2)建立SYBRGreenⅠ熒光RQ—PCR檢測水體中日本血吸蟲DNA的方法，作DNA濃度對數(shù)和初始循環(huán)數(shù)(C

2、t值)的標準曲線，評價方法的可靠性。(3)定量檢測水體中日本血吸蟲尾蚴，作尾蚴數(shù)的對數(shù)和Ct值的標準曲線，評估水體中日本血吸蟲尾蚴的數(shù)量。(4)比較RQ—PCR法與ELISA法的早期檢測日本血吸蟲尾蚴感染的效果，選擇較好的早期診斷方法。
　　 方法：(1)設(shè)計常規(guī)PCR引物，建立溫度梯度PCR，并對擴增產(chǎn)物進行測序，確定保守序列。(2)根據(jù)測序結(jié)果，針對三個重復序列的保守序列設(shè)計RQ—PCR引物，通過建立溫度梯度和濃度梯度RQ—

3、PCR，確定豐度較高的靶序列。(3)在較適宜的反應條件下，作日本血吸蟲DNA濃度對數(shù)和Ct值的標準曲線，得到相關(guān)系數(shù)。(4)繪制日本血吸蟲尾蚴數(shù)量和Ct值的標準曲線，得到相關(guān)系數(shù)。(5)分別用ROSE法和全基因組提取試劑盒提取5、10和20條尾蚴感染第2、4、6、8和15天的小鼠血清中DNA，用RQ—PCR進行檢測；用ELISA法檢測第1、2、3和4w感染尾蚴的小鼠血清中抗日本血吸蟲蟲體抗原的IgG，確定可檢測到小鼠感染日本血吸蟲尾蚴的

4、最早時間。
　　 結(jié)果：(1)普通PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電脈，表明：psjrh1．0和18SrRNA在退火溫度57．4℃下，引物濃度為20pmol時，反應體系較佳；G55A在退火溫度58．8℃下，引物濃度為20pmol時，反應體系較佳。對其測序結(jié)果表明：psjrh1．0的產(chǎn)物與NCBI發(fā)表序列比較，只有一個堿基不同；18SrRNA的產(chǎn)物與NCBI發(fā)表序列比較，完全相同；而G55A的變異性較大，與NCBI發(fā)表序列比較，有20多個

5、堿基不同。(2)設(shè)計熒光RQ—PCR引物，擴增片段約為160bp，溫度梯度PCR表明：三個重復序列的最佳反應條件為退火溫度58℃；與18SrRNA和G55A比較，psjrh1．0在基因組中的豐度最高。(3)以psjrh1．0為靶序列建立RQ—PCR可檢測到日本血吸蟲成蟲基因組DNA的濃度為2fg，用配套軟件繪制2fg～2×108fg的標準曲線，相關(guān)系數(shù)為0．9977，而對DNA為0．2fg的濃度下和陰性對照雙蒸水的檢測結(jié)果為陰性。重復實

6、驗表明，其變異系數(shù)小于2％，可靠性很好。(4)分別提取1、5、10、20和80條日本血吸蟲尾蚴的DNA，建立尾蚴條數(shù)的對數(shù)和Ct值的標準曲線，其相關(guān)系數(shù)為0．9186，相關(guān)性良好。重復實驗和標準曲線的變異系數(shù)都小于3％，可靠性良好。(5)對ROSE法和試劑盒法提取感染小鼠血清中DNA的檢測結(jié)果表明：ROSE法較試劑盒法的檢測陽性率更高。感染10條尾蚴的小鼠第2w的檢測結(jié)果為陽性，而用ELISA法檢測第4w仍為陰性。
　　 結(jié)論：