LAMP檢測(cè)法用于日本血吸蟲病早期診斷診療效考核的研究.pdf

1、研究表明核酸檢測(cè)法用于日本血吸蟲感染家兔血清特異性DNA的檢測(cè)具有早期診斷和療效考核價(jià)值。本研究成功建立了具有高度敏感性和特異性的LAMP法，并在前期中、高感染度動(dòng)物模型的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討LAMP檢測(cè)法對(duì)日本血吸蟲低感染度家兔模型早期診斷和療效考核的價(jià)值，并對(duì)LAMP體系進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)評(píng)價(jià)了本課題組所建立的3種核酸檢測(cè)法應(yīng)用于日本血吸蟲病患者的診斷及療效考核效果。全文共分為五個(gè)部分：
　　 第一部分 LAMP法反應(yīng)體系的

2、建立及對(duì)日本血吸蟲感染家兔血清DNA的檢測(cè)
　　 在已建立的兩種PCR法核酸檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步建立了一種新型快速、靈敏的核酸檢測(cè)法，即環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法(簡(jiǎn)稱LAMP法)，并與兩種PCR法比較檢測(cè)的敏感性和特異性，結(jié)果表明，LAMP法的敏感性為nested-PCR法的10倍，為普通PCR法的100倍，可擴(kuò)增出含有1.02個(gè)拷貝的質(zhì)粒DNA，亦未見與曼氏血吸蟲、華支睪吸蟲和旋毛蟲的交叉反應(yīng)。在日本血吸蟲中高度感染家兔模

3、型的早期診斷和療效考核的實(shí)驗(yàn)中，LAMP法同樣可從感染后第3d的血清中檢測(cè)出陽性結(jié)果，對(duì)療效考核的評(píng)價(jià)表明LAMP法在治療后第17w時(shí)即轉(zhuǎn)為陰性，與nested-PCR法轉(zhuǎn)陰時(shí)間一致，較PCR法晚1w轉(zhuǎn)陰，顯示出其具有更高的敏感性。
　　 第二部分 LAMP檢測(cè)法反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化
　　 對(duì)LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果表明，LAMP反應(yīng)體系最佳內(nèi)引物濃度為0.96μM，最佳Mg2+濃度為4mM，最佳dNTPs濃度為1

4、.0mM。模板抽提法采用性價(jià)比較好的酚氯仿萃取法。向LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ染料，觀察其顏色改變來判斷擴(kuò)增結(jié)果較在反應(yīng)體系中加入熒光染料，通過觀察熒光反應(yīng)來判斷擴(kuò)增結(jié)果更為準(zhǔn)確。
　　 第三部分 LAMP檢測(cè)法對(duì)低感染度日本血吸蟲病早期診斷及療效考核效果的評(píng)價(jià)
　　 在前期中度感染動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究取得良好效果的基礎(chǔ)上，建立了四組更加符合現(xiàn)場(chǎng)病人實(shí)際狀況的低感染度動(dòng)物模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)核酸檢測(cè)法特別是LA

5、MP法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示三種核酸檢測(cè)法均可從四種不同低感染度家兔模型感染后3d及1w～7w的外周血清中擴(kuò)增到日本血吸蟲特異性DNA片段，尤其是可從感染30條血吸蟲尾蚴的家兔外周血清檢測(cè)出特異性DNA片段，其EPG僅為14。對(duì)四種不同低感染度日本血吸蟲病家兔模型療效考核的結(jié)果表明，LAMP法對(duì)感染200條和100條日本血吸蟲尾蚴的家兔均于治療后第14w(感染后21w)血清中的血吸蟲DNA轉(zhuǎn)為陰性，與nested-PCR的陰轉(zhuǎn)時(shí)間一致

6、，較普通PCR法晚2w轉(zhuǎn)陰。對(duì)感染50條和30條日本血吸蟲尾蚴的家兔血清的檢測(cè)結(jié)果則顯示，LAMP法于治療后第10w(感染后17w)宿主血清中的血吸蟲DNA轉(zhuǎn)為陰性，與nested-PCR的陰轉(zhuǎn)時(shí)間一致，較普通PCR法晚1w轉(zhuǎn)陰。結(jié)果表明LAMP法對(duì)家兔血清DNA檢測(cè)的敏感性與nested-PCR法相當(dāng)，較普通PCR法高，且療效考核的效果與感染度相關(guān)，即感染度越重，血清中血吸蟲DNA轉(zhuǎn)陰所需時(shí)間越長(zhǎng)。且LAMP法較普通PCR法和nest

7、ed-PCR法結(jié)果更加直觀，無需進(jìn)行電泳，肉眼即可判斷陽性結(jié)果，具有潛在的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用前景。
　　 第四部分 LAMP檢測(cè)法在日本血吸蟲病患者診斷及療效考核中的應(yīng)用
　　 對(duì)110例糞檢陽性的慢性病人血清DNA的檢測(cè)結(jié)果表明，LAMP法的陽性率為95.5％(105/110)，nested-PCR法的陽性率為89.1％(98/110)，普通PCR法的陽性率為87.3％(96/110)。對(duì)45例非疫區(qū)正常人的檢測(cè)結(jié)果顯示，普通P

8、CR法、nested-PCR法和LAMP法的特異性均為100％。三種核酸檢測(cè)法即普通PCR法、nested-PCR法和LAMP法的陰性預(yù)測(cè)值(NPV)分別為87.5％、88.9％和95％，陽性預(yù)測(cè)值(PPV)分別為93.2％，91.6％和91.3％。對(duì)47例治療后三個(gè)月、六個(gè)月和九個(gè)月病人血清的檢測(cè)結(jié)果顯示，三種核酸檢測(cè)法的陰轉(zhuǎn)率均隨治療后時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。LAMP法的陰轉(zhuǎn)率分別為23.4％，61.7％和83.0％，普通PCR法的陰轉(zhuǎn)率

9、分別為31.2％，68.1％和89.4％，nested-PCR法的陰轉(zhuǎn)率分別為27.7％，76.6％和85.1％。而免疫學(xué)診斷方法ELISA的陰轉(zhuǎn)率分別為17.0％，19.1％和25.5％，IHA的陰轉(zhuǎn)率分別為23.4％，42.5％和31.9％，三種核酸檢測(cè)法和兩種免疫學(xué)診斷法對(duì)治療后九個(gè)月病人血清的陰轉(zhuǎn)率存在顯著差異，P<0.05。
　　 第五部分 LAMP檢測(cè)法對(duì)不同感染度日本血吸蟲病患者的診斷及療效考核價(jià)值
　　

10、對(duì)110例慢性病人血清和47例治療后病人血清按照EPG水平進(jìn)行分類，進(jìn)一步評(píng)價(jià)LAMP檢測(cè)法對(duì)日本血吸蟲病患者的診斷及療效考核價(jià)值。檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMP法對(duì)高感染度病人血清的陽性檢出率為100％(4/4)，對(duì)中感染度的陽性檢出率為92.3％(12/13)，對(duì)低感染度的陽性檢出率為95.7％(89/93)。普通PCR法對(duì)高中低度病人血清的陽性檢出率分別為100％(4/4)，84.6％(11/13)，86.0％(80/93)，nested

11、-PCR法則分別為100％(4/4)，100％(13/13)和87.1％(81/93)，ELISA分別為100％，84.6％和83.9％，IHA分別為100％，92.3％和91.4％，三種核酸檢測(cè)法與兩種免疫學(xué)檢測(cè)法的陽性檢出率均與感染度相關(guān)。LAMP法對(duì)47例高、中、低感染度病人血清治療后九個(gè)月的陰轉(zhuǎn)率分別為100％，100％和79.5％，普通PCR法分別為100％，100％和87.2％，nested-PCR法分別為100％，100％

12、和82.1％，兩種免疫學(xué)檢測(cè)法(ELISA和IHA)均維持在較低水平，陰轉(zhuǎn)率分別在0％～28.2％和0％～33.3％之間，與核酸檢測(cè)法的陰轉(zhuǎn)率存在顯著差異，P<0.05。
　　 LAMP法的敏感性與nested-PCR相當(dāng)或稍高，顯著高于普通PCR法，在對(duì)療效考核的評(píng)價(jià)中，與nested-PCR法和普通PCR法具有較好的一致性，kappa值分別為0.604.和0.735。但由于其操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、結(jié)果直觀、成本低廉，無需昂貴儀