核酸檢測(cè)技術(shù)在日本血吸蟲(chóng)感染宿主早期診斷及療效考核中的應(yīng)用研究.pdf

1、本研究擬在課題組在已成功建立PCR法檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)特異性DNA的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索核酸檢測(cè)技術(shù)在日本血吸蟲(chóng)病早期診斷及療效考核中的應(yīng)用。首先驗(yàn)證了PCR法對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染家兔模型的不同組織樣本(包括日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)、蟲(chóng)卵、感染家兔的肝組織、糞便和外周血清)中日本血吸蟲(chóng)特異性DNA的檢測(cè)結(jié)果，且進(jìn)一步確定了PCR法檢測(cè)的敏感性和特異性，結(jié)果顯示其敏感性為80fg/μL的DNA水平，所檢測(cè)的DNA片段是日本血吸蟲(chóng)特異的，與曼氏血吸蟲(chóng)及華支

2、睪吸蟲(chóng)均無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)感染家兔的血清DNA的檢測(cè)結(jié)果證明了PCR法對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染的早期診斷和療效考核價(jià)值，即可從感染后第1w的血清中擴(kuò)增出特異條帶，于治療后第12w即轉(zhuǎn)為陰性，與以往研究結(jié)果基本一致。 在已建立的PCR法的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步建立了一種新型快速、靈敏的核酸檢測(cè)法，即環(huán)媒介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法(簡(jiǎn)稱(chēng)LAMP法)，并與PCR法比較檢測(cè)的敏感性和特異性，結(jié)果表明，LAMP法的敏感性顯著高于PCR法，約為PCR法的104倍，

3、可擴(kuò)增出極微量水平的DNA(0.08fg／μl)，亦未見(jiàn)與曼氏血吸蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)的交叉反應(yīng)。在日本血吸蟲(chóng)感染家兔模型的早期診斷和療效考核的實(shí)驗(yàn)中，LAMP法同樣可從感染后第1w的血清中檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)療效考核的評(píng)價(jià)表明LAMP法在治療后第13w時(shí)即轉(zhuǎn)為陰性，較PCR法晚一周轉(zhuǎn)陰，顯示出其具有更高的敏感性。 為深入探討日本血吸蟲(chóng)感染宿主血清中核酸物質(zhì)的來(lái)源，本實(shí)驗(yàn)建單、雙性感染小鼠模型進(jìn)行研究。結(jié)果初步證實(shí)在日本血吸蟲(chóng)感染早期，

4、血清中的核酸物質(zhì)可能主要來(lái)源于移行過(guò)程中死亡的童蟲(chóng)以及蟲(chóng)體發(fā)育過(guò)程中更新脫落的表皮組織，而在感染的急性期和慢性期，小鼠血清中的核酸物質(zhì)可能主要來(lái)源于蟲(chóng)卵的分解產(chǎn)物。從而為應(yīng)用核酸檢測(cè)法早期診斷日本血吸蟲(chóng)感染，尤其是為療效考核提供了理論依據(jù)。 在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用兩種核酸檢測(cè)法檢測(cè)了30例日本血吸蟲(chóng)病慢性期病人血清。結(jié)果顯示，PCR法可從30例病人血清中檢測(cè)出18例陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性率為60％，而LAMP法可檢測(cè)出29例陽(yáng)