Real-time PCR檢測弓形蟲方法學(xué)的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、 本文目的是建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測弓形蟲的方法，并將此方法應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測，以期為弓形蟲的早期診斷和治療療效的監(jiān)測提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法：1.根據(jù)弓形蟲RH株529bp重復(fù)片斷段，設(shè)計(jì)并合成引物和TaqMan-MGB探針；將PCR擴(kuò)增的特異片段克隆入T載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α中。2.重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定后，作為陽性模板用于Real-time PCR的建立，包括PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以及敏感性、特異

2、性、重復(fù)性的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.將建立的Real-time PCR用于臨床婦女血液標(biāo)本弓形蟲的檢測，其結(jié)果與巢式PCR和ELISA的結(jié)果相比較。結(jié)果：1.確立了Real-time PCR最佳反應(yīng)條件。2.應(yīng)用定量陽性重組質(zhì)粒制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線其循環(huán)閾值與起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值之間具有良好的線形關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于99﹪，試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間變異系數(shù)均小于5﹪，無非特異性擴(kuò)增，與普通PCR相比，該方法更加靈敏、簡便、快速。3.對(duì)臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果顯示，R