重組慢病毒CXCR7-shRNA對人膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、第一章趨化因子受體CXCR7在人膀胱癌中的表達(dá)情況
　　 目的:研究CXCR7在人膀胱癌中的表達(dá)情況并篩選高表達(dá)CXCR7的人膀胱癌細(xì)胞株進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)
　　 方法:1.采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測人膀胱癌、癌旁組織以及非癌膀胱組織中CXCR7的表達(dá)情況;分析CXCR7表達(dá)情況與膀胱癌病理分級、分期的關(guān)系;2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測人膀胱癌5637和T24細(xì)胞株中CXCR7-mRNA的表達(dá)情況
　　 結(jié)果:1

2、.CXCR7在膀胱癌中的表達(dá)明顯要高于癌旁組織(p＜0.05)及非癌膀胱組織(p＜0.05)，癌旁組織和正常膀胱組織之間CXCR7的表達(dá)差異無顯著性(p=0.55);2.膀胱癌組織中CXCR7的表達(dá)量與癌細(xì)胞病理分級(p=0.011)及病理分期(p＜0.05)相關(guān)。膀胱癌分化越差、分期越晚，CXCR7的表達(dá)量越高;3.CXCR7-mRNA在人膀胱癌5637細(xì)胞株中表達(dá)高于T24細(xì)胞株
　　 結(jié)論:1.CXCR7在膀胱癌組織中高表

3、達(dá)，且其表達(dá)水平與膀胱癌病理分級、分期呈正相關(guān);2.人膀胱癌5637細(xì)胞株中CXCR7高表達(dá)，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)
　　 第二章構(gòu)建以慢病毒為載體的CXCR7-shRNA
　　 目的:篩選有效CXCR7-siRNA并構(gòu)建LV-CXCR7-shRNA
　　 方法:1.設(shè)計(jì)三條CXCR7-siRNA序列，構(gòu)建pSilencerTM4.1-CXCR7-shRNA和pcDNA3.1(+)-CXCR7過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后

4、，通過QPCR和western blot篩選干擾效果最佳的CXCR7-siRNA序列;2.以干擾效果最佳的CXCR7-siRNA為基礎(chǔ)，采用Invitrogen公司生產(chǎn)的三質(zhì)粒慢病毒載體系統(tǒng)（包括pAJ-U6--CMV-GFP/PuroR、pMD2.G和psPAX2）構(gòu)建LV-CXCR-shRNA，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備
　　 結(jié)果:1.將構(gòu)建成功的pSilencerTM4.1-CXCR7-shRNA-1、2、3干擾質(zhì)粒，與pcDNA

5、3.1(+)-CXCR7過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞中CXCR7-mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(p＜0.05)，CXCR7-mRNA表達(dá)下調(diào)比例分別為93.0％、91.54％和89.06％。2.以CXCR7-siRNA-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的LV-CXCR7-shRNA測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒無突變和插入，結(jié)果符合預(yù)期;3.重組慢病毒質(zhì)粒大量包裝后滴度測定結(jié)果為4.2×108，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求
　　 結(jié)論:CXCR7-siRNA-1

6、為干擾效果最好序列，以此序列為基礎(chǔ)成功構(gòu)建LV-CXCR7-shRNA
　　 第三章LV-CXCR7-shRNA干擾質(zhì)粒對人膀胱癌5637細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 目的:研究LV-CXCR7-shRNA對5637細(xì)胞的干擾效果
　　 方法:將培養(yǎng)好的5367細(xì)胞分為三組:實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染LV-CXCR7-shRNA質(zhì)粒;陰性對照組轉(zhuǎn)染LV-shRNA陰性對照質(zhì)粒;空白組轉(zhuǎn)染空白慢病毒質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后，1.分別采用QPCR

7、和western blot檢測各組細(xì)胞中CXCR7-mRNA和蛋白的表達(dá)情況;2.MTT實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖能力;3.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲能力
　　 結(jié)果:1.所構(gòu)建的重組質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染至各組5637細(xì)胞中;2.經(jīng)過QPCR及western blot檢測，shRNA組（實(shí)驗(yàn)組）細(xì)胞中的CXCR7-mRNA和相應(yīng)蛋白的表達(dá)量較Con組（陰性對照組）和NC組（空白組）明顯下調(diào)(p＜0.05);3.MTT實(shí)驗(yàn)顯示