表達(dá)Cdc42-shRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:膀胱癌在西方國(guó)家其發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)腫瘤的第二位，在中國(guó)居第一位，而且有逐漸增加的趨勢(shì)。然而，由于缺乏有效的治療手段，晚期膀胱癌患者的長(zhǎng)期生存率很低。為了尋找更有效的治療手段，一個(gè)關(guān)鍵的問題是找到那些易被檢測(cè)并與腫瘤的發(fā)展和惡性程度一致的分子標(biāo)記。細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cdc42)屬于：Rho GTP酶家族，作為一個(gè)GTP結(jié)合蛋白開關(guān)調(diào)節(jié)多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，控制一些關(guān)鍵的細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞形態(tài)、粘附、遷移和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等

2、。有些資料表明，Cdc42分子在膀胱癌組織比非腫瘤的膀胱組織表達(dá)增多，而且Cdc42的過表達(dá)與不少腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。作為一種特異而有效的基因沉默技術(shù)，RNAi(RNA干擾)已廣泛用于分析與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的功能，而且RNAi技術(shù)在許多腫瘤已展示其巨大的治療潛力。 目的:構(gòu)建表達(dá)、Cdc42-shRNA的慢病毒載體質(zhì)粒，評(píng)估其轉(zhuǎn)染EJ和T24兩種膀胱癌細(xì)胞后對(duì)Cdc42 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)、對(duì)STAT3 mRNA和蛋白質(zhì)

3、表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞粘附的影響。 方法:化學(xué)合成的寡核苷酸由兩個(gè)19 nt方向相反的干擾序列及其在兩序列之間插入7 nt的間隔序列和3'末端的5個(gè)脫氧胸苷酸組成。模板寡核苷酸退火后與線性化的pSIH-H1載體連接產(chǎn)生重組慢病毒載體質(zhì)粒pSIH-H1-Cde42-shRNA，此載體再經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序確認(rèn)。然后分別用pSIH-H1-Cdc42-shRNA和pSIH-H1-Luciferase-shR

4、NA(對(duì)照)轉(zhuǎn)染EJ和T24細(xì)胞。利用普通倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，利用MTF分析檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附性，而Hoechst 33258染色和DNA梯狀電泳用于細(xì)胞凋亡分析。此外，利用半定量RT-PCR評(píng)估Cdc42和STAT3 mRNA表達(dá)水平，而Western blotting用于檢測(cè)Cdc42和STAT3蛋白表達(dá)。 結(jié)果: (

5、1)成功構(gòu)建了重組慢病毒載體質(zhì)粒pSIH-H1-Cdc42-shRNA。(2)重組載體轉(zhuǎn)染EJ和T24細(xì)胞72小時(shí)后，其轉(zhuǎn)染效率均50％以上。Cdc42的下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓。(3)用pSIH-H1-Cdc42-shRNA轉(zhuǎn)染后，Cdc42 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)逐漸減少。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，其mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)在EJ細(xì)胞分別下降89％和81％，在T24細(xì)胞分別下降90％和85％，而pSIH-H1-Lucife

6、rase-shRNA轉(zhuǎn)染的兩種細(xì)胞Cdc42基因表達(dá)沒有明顯改變。(4)Cdc42沉默能顯著減少兩種膀胱癌細(xì)胞磷酸化STAT3蛋白水平，但STAT3mRNA和總STAT3蛋白質(zhì)水平與對(duì)照組相比沒有改變。(5)與對(duì)照組相比，Cdc42沉默后，T24和EJ細(xì)胞的增殖能力顯著下降。而且Cdc42下調(diào)也能顯著減少S期細(xì)胞的百分率(EJ細(xì)胞減少71.2％，T24細(xì)胞減少48.0％)，G<,1>期細(xì)胞百分率相應(yīng)增加。(6)Hoeehst33258染

7、色EJ細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Cdc42沉默能使細(xì)胞核碎片增加并出現(xiàn)凋亡小體，而DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳中亦發(fā)現(xiàn)典型的DNA梯狀現(xiàn)象。此外，Cdc42沉默能顯著減少腫瘤細(xì)胞與胞外基質(zhì)粘附的能力(EJ細(xì)胞減少65.3％，T24細(xì)胞減少74.5％)。 結(jié)論：構(gòu)建的靶向Cdc42的慢病毒載體質(zhì)粒在兩種膀胱癌細(xì)胞中能有效地下調(diào)Cdc42 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)、導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、減少細(xì)胞粘附以及下調(diào)STAT3的磷酸化