siRNA干擾TGFBR3對膀胱癌T24細胞生物學行為的影響.pdf

1、背景與目的：
　　背景：研究表明TGFBR3在人類多種腫瘤中表達異常，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本課題組前期研究顯示：在膀胱癌組織中，TGFBR3表達異常，可能發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。但其在膀胱癌細胞中的表達及其對膀胱癌生物學行為的影響還未見相關報道。
　　目的：本實驗通過檢測及siRNA干擾TGFBR3在膀胱癌細胞中的表達，進而研究其對膀胱癌生物學行為的影響。
　　方法：利用qRT-PCR及Western Bl

2、otting檢測正常膀胱上皮細胞株SV-HUC-1、膀胱癌細胞株5637及T24中TGFBR3的表達，篩選出高表達TGFBR3的細胞株。使用化學合成的siRNA干擾高表達TGFBR3的細胞株，并進行體外實驗觀察TGFBR3對膀胱癌生物學行為的影響。設計并合成四對特異性干擾TGFBR3的siRNA，利用qRT-PCR篩選出可以有效干擾TGFBR3 mRNA達75%以上的序列，進行后續(xù)實驗。應用WST-1細胞增殖實驗及平板克隆形成實驗研究干

3、擾TGFBR3后膀胱癌細胞生長及活性的變化，選擇PI染色法研究干擾TGFBR3后膀胱癌細胞細胞周期分布的變化，進行劃痕實驗及Transwell遷移、侵襲實驗研究干擾TGFBR3后膀胱癌細胞運動、遷移、侵襲能力的變化。
　　結果：本組PCR及Western Blotting實驗：無論在mRNA水平還是在蛋白水平，TGFBR3在三株細胞中的表達為：T24最高，SV-HUC-1其次，5637最低。三者mRNA表達量分別為3.420±0.

4、0875、1.000±0.1800、0.620±0.1270(P＜0.05)。因此選用T24細胞作為后續(xù)RNAi的工具細胞。設計合成的四對siRNA-R3-1-4均可以降低T24細胞TGFBR3的表達，干擾效率分別為：85.48%、89.37%、79.83%、68.78%(P＜0.001)。因此選擇siRNA-R3-1-3用于后續(xù)實驗。WST-1結果顯示：與Mock組、siRNA-NC組相比，轉染后48h時，siRNA-TGFBR3組細

5、胞的生長及活性降低（P＜0.01），72h時兩者差異進一步增大（P＜0.001）。平板克隆形成實驗結果顯示：與Mock組、siRNA-NC組相比，siRNA-TGFBR3組克隆形成數明顯減少（P＜0.05）。碘化丙啶染色實驗結果表明：siRNA-TGFBR3組與siRNA-NC組細胞周期分布相似，未見明顯sub-G1峰。劃痕實驗結果說明：siRNA-TGFBR3組較siRNA-NC組細胞運動能力減弱。進一步的Transwell遷移侵襲實

6、驗顯示：siRNA-NC、siRNA-TGFBR3兩組遷移到下室的每視野細胞數分別為258.0±12.5個、62.7±6.0個（P＜0.001），siRNA-NC、siRNA-TGFBR3兩組侵襲到下室的每視野細胞數分別為158.4±20.8個、20.3±8.5個（P＜0.001）。
　　結論:
　　1.本實驗明確顯示TGFBR3在膀胱癌細胞株中的表達情況，TGFBR3在5637細胞中表達較SV-HUC-1低，而在T24細胞