抑制TGF-β1-Smad信號通路促進肩袖骨-肌腱結(jié)合部愈合的研究.pdf

1、研究背景:肩袖損傷后，其腱骨愈合受到多方面因素的影響，包括機械應(yīng)力、炎癥反應(yīng)和細胞因子等很多方面，腱骨界面(BTJ)常常被認為是關(guān)節(jié)損傷修復(fù)早期的薄弱點。臨床資料顯示，外科手術(shù)修補后的肩袖以瘢痕重塑的形式愈合，由多種炎癥因子和生長因子參與修復(fù)重建過程。這種非完全重建式的愈合使得肩袖組織的生物力學(xué)強度遠遠低于正常水平，最終結(jié)果往往導(dǎo)致術(shù)后肩袖再撕裂的發(fā)生。TGF-β1是促使BTJ愈合中瘢痕形成的關(guān)鍵因子，前人研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制TGF-β1

2、/Smad信號通路可以抑制瘢痕增生。在此基礎(chǔ)上，本研究擬構(gòu)建SD大鼠岡上肌BTJ損傷的修復(fù)模型，在體研究TGF-β1及Smad在其愈合過程中的分布與瘢痕形成的相關(guān)性;分別在愈合與重塑的不同時期，用針對沉默TGF-β1、Smad蛋白家族設(shè)計的慢病毒感染BTJ，抑制TGF-β1/Smad信號通路，觀察抑制后的BTJ細胞和細胞外基質(zhì)的變化及相關(guān)生物學(xué)、生物力學(xué)的改變，探究此信號通路對肩袖BTJ愈合的調(diào)節(jié)機制，為臨床治療提供新思路。
　　

3、研究目的:本課題擬通過構(gòu)建SD大鼠單側(cè)岡上肌損傷修復(fù)模型，在體研究TGF-β1及Smad在其愈合過程中的分布與瘢痕形成的相關(guān)性;分別在愈合與重塑的不同時期，用針對沉默TGF-β1、Smad蛋白家族表達的慢病毒感染BTJ，抑制TGF-β1/Smad信號通路，觀察抑制后的BTJ細胞和細胞外基質(zhì)的變化及相關(guān)生物學(xué)、生物力學(xué)的改變，探究此信號通路對肩袖BTJ愈合的調(diào)節(jié)機制。
　　研究方法:
　　1、實驗設(shè)計:選取雄性SD大鼠50只（

4、第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供），體重(150-200)g，其中10只不做手術(shù)處理作為①空白對照組。剩余40只模擬行單側(cè)（左上肢）岡上肌肩袖組織撕裂修補術(shù)，術(shù)后平均分為4組，在術(shù)后3d、5d、10d在岡上肌肩袖局部分別給予不同藥物注射處理，根據(jù)注射藥物的不同分為②生理鹽水對照組、③TGFβ1抑制組、④Smad2抑制組、⑤TGFβ1/Smad2共同抑制組，藥物注射治療后分別在第7d、14d、21d、28d各處死2只SD大鼠，留取左上肢岡上肌

5、局部標本，進行生物力學(xué)檢測和組織學(xué)、免疫組化觀察，評估肩袖愈合效果。
　　2、模型制備的手術(shù)方法:SD大鼠采用10％水合氯醛生理鹽水溶液（按照體重標準0.4ml/500g）腹腔注射麻醉，麻醉完成后，在固鼠板上用皮筋固定大鼠四肢（俯臥位固定），用剃毛器刮凈左上肢局部毛發(fā)，用1％醫(yī)用碘伏消毒備皮區(qū)，鋪無菌單?？v行切開皮膚，長約3-4cm，分離淺筋膜至暴露肩胛區(qū)及上臂肌肉，找到斜方肌附著部，沿斜方肌境界輕柔切開此肌肉，向前上方翻開即可見

6、岡上肌正位于斜方肌覆蓋之下。仔細分離整條岡上肌至肱骨大結(jié)節(jié)止點，切斷少許三角肌充分暴露岡上肌在肱骨大結(jié)節(jié)的附著部位，鈍性撕脫岡上肌在肱骨大結(jié)節(jié)處的附著，用巾鉗在肱骨大結(jié)節(jié)上建立骨隧道，方向與岡上肌在骨質(zhì)表面的附著走形一致，再用不可吸收縫線分別在岡上肌組織末端間隔1.5-2mm縫合組織，并將縫線穿過骨道打結(jié)固定，將岡上肌腱縫合在原來的足印區(qū)，建立SD大鼠單側(cè)岡上肌損傷修復(fù)模型備用。
　　3、分階段抑制TGFβ1/Smad信號通路

7、r>　　1)針對TGFβ1、Smad2的siRNA的設(shè)計、合成和篩選根據(jù)siRNA設(shè)計原理和要求，針對SD大鼠TGFβ1、Smad2基因序列特征，為每個基因分別設(shè)計合成三對熒光報告基因標記siRNA;脂質(zhì)體包裹siRNA，以相同濃度，相同作用時間轉(zhuǎn)染SD大鼠成纖維細胞;Rt-PCR，Western Blot篩選高效特異的siRNA;確定最佳轉(zhuǎn)染濃度和時間。
　　2) TGFβ1、Smad2的慢病毒感染效果及評價根據(jù)siRNA的位點

8、序列合成相應(yīng)的shRNA質(zhì)粒，并包裝出相應(yīng)的慢病毒，感染大鼠成纖維細胞驗證其對靶基因的抑制效率
　　3)分階段抑制注射在BTJ愈合和重塑的不同階段，注射慢病毒抑制TGFβ1/Smad通路，術(shù)后3d、5d、10d連續(xù)給藥3次，注射慢病毒感染大鼠單側(cè)（左上肢）BTJ部位。
　　4、取材及制作標本:藥物注射治療后每組分別在第7d、14d、21d、28d各處死2只SD大鼠，留取左上肢岡上肌局部標本，進行生物力學(xué)檢測和組織學(xué)、免疫組化

9、觀察，評估肩袖愈合效果;切取肩胛骨及與其相連的肱骨為一個完整部位行生物力學(xué)抗拉力測試，同時取1只正常組大鼠的左側(cè)BTJ樣本為對照。生物力學(xué)測試完成后的標本，取大結(jié)節(jié)足印區(qū)的組織(厚約5mm)進行脫鈣固定留備，染色、免疫組化檢測，比較愈合過程不同時間BTJ中瘢痕組織的形成和轉(zhuǎn)歸的特點，以及纖維軟骨的分布及其與正常BTJ的差別。
　　5、觀察方法和結(jié)果測定:生存狀態(tài)觀察:首先在取材之前對于不同實驗組的SD大鼠，比較其在術(shù)前、術(shù)后不同時

10、間節(jié)點的生存狀態(tài)，比如動物活動狀態(tài)、手術(shù)切口愈合情況（有無感染等炎癥反應(yīng)）、肢體活動度等等。
　　HE染色觀察:組織經(jīng)過固定、脫鈣、脫水、清洗、包埋、切片和染色，可見細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈淡紅色。
　　Masson三色法染色觀察:膠原纖維呈藍色，肌纖維、細胞質(zhì)、纖維素、角蛋白和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色。
　　6、統(tǒng)計學(xué)分析:各組動物之間在各時間點的生物力學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析采用SNK-q檢驗(Student-Newma

11、n-Keuls test)，以明確各組之間各個時間節(jié)點的腱骨愈合是否存在差異。
　　研究結(jié)果:
　　1、大體結(jié)果:手術(shù)組與非手術(shù)組對比:手術(shù)組動物在術(shù)后出現(xiàn)活動度減退，肢體活動度受限的情況，影響大鼠行走步態(tài)（跛行或者拖行），部分出現(xiàn)傷口崩裂、局部組織感染化膿（感染率為20％）;飲食無明顯變化;手術(shù)組動物易激惹。接受手術(shù)的動物，不同給藥治療組之間的比較:大鼠生存狀態(tài)無明顯異常，感染率無明顯差別(20％)。
　　2、組織切

12、片染色結(jié)果
　　1)手術(shù)組動物(②③④⑤)肩袖BTJ最終達到瘢痕愈合;局部瘢痕生成的量有所不同;
　　2)⑤組動物最終愈合結(jié)果的瘢痕與②③④組比較明顯減少，愈合效果最好，肉眼觀察有差異;②③④組間結(jié)果比較，在肉眼下觀察無明顯差異，BTJ處有較多的瘢痕組織及雜亂的新生膠原纖維;
　　3)成纖維細胞含量:①空白對照組45％;②生理鹽水對照組78％;③TGF-β1抑制組70％;④Smad2抑制組75％;⑤TGF-β1/Sma

13、d2共抑制組50％。
　　3、免疫熒光、Rt-PCR、Western Blot檢測結(jié)果
　　1)細胞基質(zhì)成分中Aggrecan、Biglycan、Elastin、Tenascin-C的含量在③④⑤組均有升高，⑤組升高最明顯;
　　2)基質(zhì)酶的改變中，MMP在③④⑤組均呈降低趨勢，在第②組呈增高趨勢，TIMP的變化趨勢與MMP相反;
　　3) COX酶含量的化各不相同，各組之間無可比性;
　　4)轉(zhuǎn)錄因子SO

14、X9的含量與第①組相比在②③④⑤組呈增高趨勢，各組之間無明顯差異;
　　5)凋亡相關(guān)因子p53,NF-κB，熱休克蛋白的變化③④⑤組總體呈降低趨勢，⑤組最明顯;而第②組結(jié)果與其他相反，呈上升趨勢，提示有組織退變的可能。
　　4、生物力學(xué)檢測結(jié)果:肩袖愈合的總體趨勢隨著時間的推移體現(xiàn)為腱骨愈合部位的終末拉力值的增強，其中，第⑤組的終末抗拉力結(jié)果優(yōu)勢最明顯。同一時間節(jié)點，各分組生物力學(xué)數(shù)據(jù)樣本均數(shù)兩兩之間的全面比較比較采用SNK

15、-q檢驗(Student-Newman-Keuls test)，按照α=0.05水準:第⑤組與②③④組在各時間節(jié)點數(shù)據(jù)比較均有統(tǒng)計學(xué)意義;第①組與②③④組在前3周數(shù)據(jù)比較有統(tǒng)計學(xué)意義，最后一周數(shù)據(jù)之間無統(tǒng)計學(xué)意義;第①組與第⑤組之間在最后一周數(shù)據(jù)相比有統(tǒng)計學(xué)意義，前三周數(shù)據(jù)相比無明顯統(tǒng)計學(xué)意義;②③④三組之間各時間節(jié)點數(shù)據(jù)比較，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)論:單側(cè)SD大鼠岡上肌損傷修復(fù)模型具有易操作、成功率高、可重復(fù)性好、模型動

16、物生存質(zhì)量穩(wěn)定、取材方便等方面的優(yōu)點，是研究肩袖病變發(fā)病機制的良好模型;HE染色是組織切片常用的染色方法，操作簡便，可以大體觀察到BTJ的組織層次，初步評價愈合效果;Masson染色可以特異性的觀察膠原纖維的分布，有助于評價肩袖愈合的效果;免疫組化、Rt-PCR和Western Blot對于生長因子，蛋白、酶類以及信號通路上的其他物質(zhì)的變化可以檢測的更為精確，發(fā)現(xiàn)信號通路抑制后愈合過程中物質(zhì)含量的變化，為進一步揭示其作用機制提供了依據(jù)。