增生性瘢痕TGF-β1-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究.pdf

1、背景：增生性瘢痕是創(chuàng)傷愈合后最常見的并發(fā)癥之一，是人體對(duì)創(chuàng)傷的一種過度的愈合反應(yīng)導(dǎo)致以成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原大量合成、膠原過度沉積為組織學(xué)特點(diǎn)的皮膚纖維增生性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)人燒傷后增生性瘢痕的發(fā)生率為91.4％，燒傷創(chuàng)面愈合時(shí)間若超過2周，增生性瘢痕發(fā)生率高達(dá)74.67％，遠(yuǎn)高于國(guó)外報(bào)道的38.00％。瘢痕形成后影響患者的容貌，并伴有癢痛，而且產(chǎn)生的攣縮可導(dǎo)致不同程度的功能障礙，如肌腱攣縮、關(guān)節(jié)脫位、運(yùn)動(dòng)功能障礙、職業(yè)心理障礙等，降

2、低了該類患者的生活質(zhì)量，為后期治療帶來沉重經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。增生性瘢痕的防治研究是一個(gè)既古老又新穎的課題。由于發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前其治療仍是臨床上頗為棘手的難題。多年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)增生性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展及消退的機(jī)理進(jìn)行了多角度、多層面的深入研究，但直至目前對(duì)其機(jī)制的研究尚無明確的結(jié)論，防治方面也尚無良方，較一致的看法有:①增生性瘢痕主要的效應(yīng)細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，并以細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征;②膠原代謝紊亂是其主要的生物學(xué)

3、層面表現(xiàn);③TGF-β1/Smad信號(hào)通路與成纖維細(xì)胞的增殖、分化、遷徙、凋亡及膠原代謝等多種生理、病理過程密切相關(guān)，Smads根據(jù)不同分型，對(duì)成纖維細(xì)胞膠原代謝具有雙向調(diào)控作用。壓力治療增生性瘢痕早在400多年前就已有報(bào)道，隨后眾多學(xué)者進(jìn)行多中心、大樣本、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)業(yè)已證實(shí)壓力在燒（創(chuàng)）傷后瘢痕的控制和預(yù)防中發(fā)揮著重要的作用。自70年代開始，壓力療法被廣泛醫(yī)生所接受，并得以推廣和應(yīng)用，目前壓力治療已成為增生性瘢痕的標(biāo)準(zhǔn)和首選治療

4、方法。但壓應(yīng)力治療增生性瘢痕療效都是基于臨床經(jīng)驗(yàn)，目前對(duì)壓力治療增生性瘢痕的機(jī)理認(rèn)識(shí)還不是十分清楚。已有研究提示瘢痕形成的主要原因之一是成纖維細(xì)胞的膠原合成代謝和分解代謝的失衡，而這二者力量的消長(zhǎng)及對(duì)比可能正是決定傷口愈合和組織重建的關(guān)鍵。壓力治療后創(chuàng)面不長(zhǎng)瘢痕或瘢痕萎縮，分析其原因可歸納如下:促瘢痕形成因素水平下降;抑制瘢痕形成因素水平的增高。其中信號(hào)通路的調(diào)控分為三個(gè)水平:細(xì)胞外刺激信號(hào)分子作用;細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)傳導(dǎo)信號(hào)分子傳遞;靶基因轉(zhuǎn)

5、錄、翻譯。多年來許多學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí):成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為，尤其是膠原代謝的改變?cè)趬毫χ委熢錾择：圻^程中起主要作用。既往壓應(yīng)力治療增生性瘢痕研究往往集中在增生性瘢痕的血供改變上，認(rèn)為壓應(yīng)力使組織血流淤積，局部缺血或淤血，組織氧分壓降低，從而抑制瘢痕的繼續(xù)增長(zhǎng)。然而，對(duì)于壓應(yīng)力是通過什么樣的機(jī)制影響了成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為及其膠原代謝知之甚少。同時(shí)，以往的研究證實(shí)TGF-β1可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上誘導(dǎo)MMP-1和TIMP-1的表達(dá)對(duì)膠

6、原代謝產(chǎn)生影響。結(jié)合以往已有研究結(jié)果證實(shí)創(chuàng)傷后增生性瘢痕組織中TGF-β1呈增高趨勢(shì)，Smad7較正常皮膚組織含量低，隨著瘢痕的成熟組織中Smad7含量明顯增高，我們聯(lián)想到壓力治療增生性瘢痕其機(jī)制可能和TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中抑制中間分子Smad3的活化或上調(diào)smad7有關(guān)，進(jìn)而調(diào)節(jié)MMPs表達(dá)而對(duì)膠原合成與降解產(chǎn)生影響。近些年來，研究機(jī)械應(yīng)力作用于活體細(xì)胞，觀察其受應(yīng)力作用后的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)、增殖、分化及凋亡等各

7、種變化，是細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)展十分迅速的研究方法，并已證明機(jī)械應(yīng)力在某些生理和病理過程中起著重要作用。因此，如果以瘢痕形成的效應(yīng)細(xì)胞—成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，從影響其膠原代謝的Smads動(dòng)態(tài)變化方面著手，以重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TGF-β1/Smads的作用為研究主線，研究壓力作用后該通路對(duì)成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為及膠原代謝平衡的調(diào)控機(jī)制，就有可能抓住壓力作用促使增生性瘢痕迅速向萎縮性瘢痕發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。檢索文獻(xiàn)少見有關(guān)壓力干預(yù)下細(xì)胞因子表達(dá)改善

8、成纖維細(xì)胞膠原代謝平衡紊亂調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究，本實(shí)驗(yàn)首次采用離體壓力模擬技術(shù)以增生性瘢痕成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，通過壓力加載系統(tǒng)作用前后細(xì)胞內(nèi)分子環(huán)境中Smad3和Smad7基因的表達(dá)與膠原代謝之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系，尋找通路中間分子與膠原代謝改變之間可能存在的壓力效應(yīng)分子;其次利用RNAi技術(shù)阻斷關(guān)鍵性的中間分子Smad3，觀察通路中間分子及膠原代謝的改變，確定信號(hào)傳導(dǎo)通路中的Smad3分子對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞膠原代謝的影響;通過上述實(shí)驗(yàn)希望獲得T

9、GF-β1/Smad信號(hào)通路對(duì)膠原代謝平衡的調(diào)節(jié)分子作用點(diǎn)，為壓力治療增生性瘢痕的部分機(jī)制提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)而初步闡明細(xì)胞重建機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控的力學(xué)效應(yīng)，并豐富相應(yīng)的理論，為創(chuàng)傷愈合后如何減少瘢痕或無瘢痕的探索開拓新的途徑。
　　 目的：①為壓力治療增生性瘢痕的部分機(jī)制提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，初步闡明機(jī)械性壓應(yīng)力通過TGF-β通路治療增生性瘢痕的分子機(jī)制。②初步闡明Smad3基因?qū)υ錾择：坌纬芍械淖饔?，進(jìn)一步完善TG

10、F-β1/smad信號(hào)通路在增生性瘢痕中的相關(guān)理論，為基因治療增生性瘢痕提供分子靶點(diǎn)和一定的理論依據(jù)。
　　 方法：⑴12例增生性瘢痕標(biāo)本及3例正常皮膚標(biāo)本，年齡20歲到60歲，收集時(shí)間為2012年3月至2012年10月，分別來自廣東省第二人民醫(yī)院和廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，標(biāo)本的獲取均征得病人的同意，簽知情同意書。標(biāo)本入選標(biāo)準(zhǔn)為:A、經(jīng)臨床醫(yī)生鑒定為增生性瘢痕組織;B、排除垂體、腎上腺疾病、傳染病、皮膚病及免疫性疾病患者，排除局部感

11、染、潰瘍患者;C、未接受任何治療。手術(shù)室無菌條件下組織切取后，放于無菌的容器中，均于2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。⑵在手術(shù)室無菌條件下，將切取的新鮮皮膚、增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩組織，4h內(nèi)帶回?zé)o菌工作間。將組織轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)中，1％雙抗的生理鹽水反復(fù)沖洗，盡量去除血污。眼科剪修除表皮和皮下組織后用反復(fù)剪切，使之成0.5～1mm3大小組織塊。吸取組織塊接種于40ml培養(yǎng)瓶瓶壁上，組織塊間留約0.3～0.5cm的間距。密閉培養(yǎng)瓶，放入37℃、5％CO2的電熱

12、恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)3.5h。待培養(yǎng)的組織小塊微干涸，取出培養(yǎng)瓶，向瓶底輕輕注入含RPMI1640+15％FBS培養(yǎng)液5ml，然后緩緩翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶壁上的組織小塊，盡量避免晃動(dòng)培養(yǎng)瓶。翻轉(zhuǎn)后，置于37℃、含5％CO2的電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。一周后取出培養(yǎng)瓶，移除瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，生理鹽水漂洗兩次后加含RPMI1640+15％FBS培養(yǎng)液5ml繼續(xù)培養(yǎng)。以后待細(xì)胞萌出后，同樣方法每周換液兩次。倒置相差顯微鏡觀察其細(xì)胞萌出、細(xì)胞形態(tài)、

13、生長(zhǎng)增殖等情況，待原代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)基本融合成片時(shí)即可常規(guī)傳代培養(yǎng)，每周換液兩次，待細(xì)胞融合成單層再次傳代。本實(shí)驗(yàn)均在第4～8代進(jìn)行。通過細(xì)胞免疫組化α-SMA染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定:將細(xì)胞培養(yǎng)在清潔滅菌的蓋玻片上，經(jīng)常規(guī)固定、脫水、抗原修復(fù)、過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，10％山羊血清封閉30min并滴加一抗1∶100稀釋的α-SMA（1∶100稀釋）4℃孵育過夜。洗滌3次后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，DAB顯色。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。顯微鏡

14、下觀察細(xì)胞中陽性細(xì)胞的百分比。⑶將增生性瘢痕成纖維細(xì)胞樣本(n=12)分為空白對(duì)照組和壓力刺激組，每組6個(gè)樣本。首先將樣品加入進(jìn)行樣本孔中，然后按照儀器FX-4000C的說明書，安裝壓縮平板，并裝在壓縮系統(tǒng)的夾緊裝置上，然后設(shè)置系統(tǒng)的參數(shù):33Hz，35mmHg動(dòng)態(tài)性壓應(yīng)力，過夜，24小時(shí)后取出細(xì)胞培養(yǎng)盤，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)全過程均是在特制的37℃，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行的。⑷通過GenBank查找TβRⅡ、smad3、smad

15、7、MMP1、MMP2、MMP9、MMP12、CollagenⅠ、collagenⅢ基因序列，使用軟件Primer-Express5.0進(jìn)行引物與探針的設(shè)計(jì)。⑸應(yīng)用熒光RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)并比較空白對(duì)照組和壓力刺激組TGF-β1受體、smad3、smad7、collagenⅠ、collagenⅢ mRNA表達(dá)量。常規(guī)Trizol試劑抽提總RNA，并鑒定其濃度、純度及完整性。取總RNA1μg加入無菌蒸餾水12μl，混勻后65℃孵育5mi

16、n，隨后立即置于冰上;將配置好的變性退火反應(yīng)液加入到含總RNA的溶液中混勻，在PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，進(jìn)行cDNA PCR反應(yīng)及熒光定量PCR反應(yīng)，設(shè)定cDNA PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃3min，變性95℃40s，退火57℃50s，延伸72℃50s，延伸:72℃10min。熒光定量PCR反應(yīng)條件為:93℃3分鐘，然后93℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共40循環(huán)。⑹將增生性

17、瘢痕成纖維細(xì)胞樣本(n=12)隨機(jī)分為空白對(duì)照組和smad3阻斷組，每組6個(gè)樣本。應(yīng)用si RNA技術(shù)，取100nmol Smad3 si RNA，在核酸轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中，阻斷smad3基因，并應(yīng)用熒光RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)并比較空白對(duì)照組和smad3阻斷組MMP1、MMP2、MMP9、MMP12、CollagenⅠ、collagenⅢ mRNA表達(dá)量。
　　 結(jié)果：

18、①空白對(duì)照組和壓力實(shí)驗(yàn)組TβRⅡ、Smad3、Smad7及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的差異性表達(dá):根據(jù)熒光RT-qPCR結(jié)果，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞系中壓力實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照組TGF-β受體表達(dá)量增高，Smad3、Smad7、CollagenⅠ表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，collagenⅢ表達(dá)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②阻斷Smad3基因?qū)嶒?yàn)組和空白對(duì)照組MMPs和膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ差異性表達(dá)。阻斷Smad3基因后，增生性瘢痕

19、成纖維細(xì)胞系中實(shí)驗(yàn)組中MMP2、MMP9、MMP12表達(dá)量較空白組表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而CollagenⅠ表達(dá)量較阻斷基因前表達(dá)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩組的MMP1、collagenⅢ表達(dá)量?jī)山M差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：⑴機(jī)械壓應(yīng)力治療增生性瘢痕可通過TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中抑制smad3的表達(dá)從而促進(jìn)Ⅰ膠原的降解，smad3可能是其關(guān)鍵的壓力效應(yīng)分