PMVECs肌樣分化及其調(diào)控通路TGF-β1-Smad在HPS中的作用.pdf

1、背景和目的:
　　肝肺綜合征((hepatopulmonary syndrome,HPS)是慢性肝病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,在肝硬化中發(fā)病率高達(dá)15％,也是引起肝移植圍手術(shù)期移植肝無功能及肺部感染的主要原因,已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。目前對(duì)于HPS的發(fā)病機(jī)制仍不明確,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肺內(nèi)微血管擴(kuò)張和分流的形成,加之缺氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vaso constriction,HPV)受損和高動(dòng)力循環(huán)的存在,導(dǎo)致HP

2、S的發(fā)生發(fā)展。HPS主要表現(xiàn)為肺內(nèi)微血管異常擴(kuò)張、氣體交換障礙、動(dòng)脈血氧合作用異常,其中以肺微血管擴(kuò)張為主要病理改變,擴(kuò)張的微血管導(dǎo)致血紅蛋白氧合困難產(chǎn)生難治性低氧血癥和低氧肺血管重建(肺平滑肌細(xì)胞的異常增殖導(dǎo)致肺動(dòng)脈壁增厚)而進(jìn)一步加重低氧血癥。肺微血管主要構(gòu)成細(xì)胞為肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs),目前的研究認(rèn)為肺微血管的擴(kuò)張主要是由于PMVECs的

3、異常增殖引起,該病理改變不具有可復(fù)性,而在對(duì)HPS病人行肝移植術(shù)后發(fā)現(xiàn),肺微血管存在一定的收縮,該現(xiàn)象無法單純用PMVECs增殖解釋;同時(shí)在我們的前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在HPS大鼠血清誘導(dǎo)的部分PMVECs內(nèi)檢測(cè)出肌性蛋白MPH、SM-α-actin、calponin的表達(dá),提示PMVECs發(fā)生肌樣化改變。轉(zhuǎn)化生子因子(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)及Smad蛋白在細(xì)胞的增殖、分化及遷移中起重

4、要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),Smad7在促進(jìn)肌性分化中起著重要并且必要的作用,另外TGF-β1/Smad中上調(diào)Smad7和下調(diào)Smad3表達(dá)均對(duì)成纖維細(xì)胞樣分化起一定的抑制作用,基于以上理由,我們推測(cè):慢性肝病導(dǎo)致多種細(xì)胞因子釋放,通過血液循環(huán)達(dá)到肺臟,作用于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路引起PMVECs發(fā)生肌樣分化,進(jìn)一步加重肺內(nèi)微血管擴(kuò)張,導(dǎo)致HPS的發(fā)生發(fā)展,這就是本研究立題的目的。本研究采用構(gòu)建HPS大鼠模型,制

5、備HPS血清,培養(yǎng)原代PMVECs,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)、蛋白印跡(Western Blot)、免疫熒光(immunofluorescence)等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)HPS大鼠血清培養(yǎng)的PMVECs內(nèi)細(xì)胞分化情況及信號(hào)通路中蛋白表達(dá)變化,探討HPS發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)分三部分:
　　1.構(gòu)建HPS大鼠模型,制備血清采用慢性膽總管結(jié)扎(CBDL)構(gòu)建H

6、PS大鼠模型,2周后行病理切片及血?dú)夥治?成功后制備血清。
　　2.PMVECs的原代培養(yǎng)及其肌樣分化的檢測(cè)
　　正常大鼠(2月齡),取肺邊緣組織行原代培養(yǎng)、純化及鑒定PMVECs。PMVECs隨機(jī)分為2組:對(duì)照組(C組)和HPS干預(yù)組(HPS組),37%二氧化碳孵育箱中培養(yǎng)24、48和72h(T1、T2、T3)后,采用顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及western blot檢測(cè)肌性蛋白表達(dá)探索PMVECs肌樣分化。
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7、.TGF-β1/Smad信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白以及mRNA表達(dá)的檢測(cè)
　　C組和HPS組PMVECs在3個(gè)時(shí)相點(diǎn)采用RT-PCR和western blot法分別檢測(cè)TGF-β1mRNA、Smad3mRNA及其蛋白表達(dá),及采用免疫熒光對(duì)Smad3蛋白細(xì)胞內(nèi)定位。
　　結(jié)果:
　　1.HPS大鼠血清對(duì)PMVECs肌樣分化的影響
　　1)在倒置顯微鏡下觀察:C組培養(yǎng)細(xì)胞狀如梭形或多角形,呈“鋪路石樣”排列,大小均勻,胞核清

8、晰,呈卵圓形,胞漿豐富。HPS組培養(yǎng)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形排列,核呈桿狀或橢圓狀。
　　2)C組PMVECs內(nèi)未見平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle-Cardiac myosin heavy chain,SM-MHC)、平滑肌肌動(dòng)蛋白α(smooth muscle-α-actin,SM-α-actin)、肌鈣蛋白(calponin)蛋白表達(dá);HPS組PMVECs內(nèi)SM-MHCSM-α-actin、calponin蛋白表達(dá)陽(yáng)性;與

9、Tl時(shí)比較,T2、T3時(shí)HPS組PMVECs內(nèi)SM-MHC、SM-α-actin、calponin蛋白表達(dá)增加(P<0.05);與T2時(shí)比較,T3時(shí)HPS組PMVECs內(nèi)SM-MHC、SM-α-actin、calponin蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。
　　2.TGF-β1/Smad信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白以及mRNA表達(dá)的檢測(cè)
　　1)與C組比較,HPS組PMVECs內(nèi)TGF-β1mRNA及其蛋白表達(dá)增加(P<0.05);與Tl

10、時(shí)比較,T2、T3時(shí)HPS組PMVECs內(nèi)TGF-β1mRNA及其蛋白表達(dá)增加(P<0.05);與T2時(shí)比較,T3時(shí)HPS組PMVECs內(nèi)TGF-β1mRNA及其蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。
　　2)C組與HPS組PMVECs內(nèi)Smad3mRNA及其蛋白表達(dá)大致相同。
　　3)C組PMVECs內(nèi)見綠色熒光主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中;而HPS組PMVECs內(nèi)綠色熒光則主要定位在細(xì)胞核中。
　　結(jié)論:
　　1.在HPS大鼠