rhBMP-2-GMS-CPC復(fù)合材料促進(jìn)骨缺損愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景
　　骨缺損的修復(fù)是骨科臨床常見和多發(fā)的棘手難題之一，傳統(tǒng)的自體及異體骨移植一直仍為首選，但均存在各自的缺點(diǎn)。磷酸鈣骨水泥(calciumphosphatecements，CPCs)作為新型的骨修復(fù)材料，具有可注射、塑形好、骨傳導(dǎo)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型自固化人工骨替代材料，但較慢的吸收降解率阻礙了其廣泛應(yīng)用；目前人們在骨組織工程的研究中，期望rhBMP-2的參與能獲得比較理想的骨組織再生。但由于將BMP單純植入機(jī)體內(nèi)擴(kuò)

2、散太快，并且BMP易被蛋白酶水解，故不能在有效的時(shí)間內(nèi)作用于更多靶細(xì)胞，生物學(xué)效能難以充分發(fā)揮，故BMP的臨床應(yīng)用需要一定的緩釋載體。雖然通過將CPC直接負(fù)載骨生長因子治療骨缺損效果良好，但CPC的因子釋放能力有限。微球用于藥物載體的研究始于20世紀(jì)70年代中期，自此以后的研究發(fā)展十分迅速。目前生長因子及可降解的微球載體材料生物學(xué)的最新成就己經(jīng)成功運(yùn)用于軟骨、骨以及其他相關(guān)組織的組織工程研究中?？山到馕⑶驍y載因子后復(fù)合磷酸鈣骨水泥，在微

3、球降解成孔的同時(shí)使因子釋放率大大增加，明顯加速復(fù)合材料的降解和誘導(dǎo)成骨。目前主要以PLGA材料制備微球，但它仍存在較為緩慢的降解率及降解產(chǎn)物呈酸性易損傷周圍組織細(xì)胞的缺點(diǎn)，而明膠微球生物相容性好，降解后形成膠原，無毒副作用，有望代替PLGA作為磷酸鈣骨水泥的良好改性材料。
　　二、研究目的
　　采用無毒、可生物降解、生物相容性好的明膠作為載體材料，優(yōu)化的雙相乳化冷凝聚合法制備rhBMP-2/GMS，對其形態(tài)、粒徑、包封率、載

4、藥率進(jìn)行檢測，測定其體外因子緩釋曲線，進(jìn)一步將其負(fù)載于磷酸鈣骨水泥，制備多孔載因子CPC，在骨缺損模型體內(nèi)，采用“生物力學(xué)特性-X線觀察-組織形態(tài)”的綜合手段，評估新型復(fù)合人工骨材料對骨缺損愈合的作用。
　　三、研究內(nèi)容和方法
　　1基因重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/明膠微球(rhBMP-2/GMs)的制備及性質(zhì)檢測根據(jù)天然明膠材料經(jīng)京尼平處理后可交聯(lián)成球及可固化的特性，采用改進(jìn)的雙相乳化冷凝聚合法制備rhBMP-2/GMs;<

5、br>　　檢測rhBMP-2/GMs載藥率及包封率，掃描電鏡觀察rhBMP-2/GMs形態(tài)及粒徑。
　　rhBMP-2/GMs體外釋藥實(shí)驗(yàn)研究：以10ml無菌PBS作為釋藥介質(zhì)，加入適當(dāng)濃度的rhBMP-2/GMS溶液1ml，混合均勻后，放置于37℃恒溫水浴振蕩器中，記錄釋藥起始時(shí)間。分別于第1-10天吸取釋藥介質(zhì)5ml，ELISA法測試藥物含量，并同時(shí)補(bǔ)充等量5ml介質(zhì)，測量每個(gè)時(shí)間段所釋放的藥物總量，進(jìn)行百分比統(tǒng)計(jì)，描繪藥物累

6、積釋藥曲線。
　　根據(jù)rhBMP-2/GMs載藥率和包封率計(jì)算出rhBMP-2含量后，以相同比例與CPC混合，分別將rhBMP-2/GMs/CPC組及rhBMP-2/CPC組各以5ml生理鹽水作為釋藥介質(zhì)，分別于1、4、7、14、21、28天收集全部浸提液，ELISA法測定rhBMP-2的濃度，從而計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積釋藥量，描繪累計(jì)釋藥曲線。
　　2.rhBMP-2/GMs/CPC體內(nèi)降解、誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)
　　制備復(fù)

7、合rhBMP-2/GMS/CPC(A組)、GMS/CPC(B組)和rhBMP-2/CPC(C組)，分別植入兔橈骨骨缺損模型中，術(shù)后6、12周行大體、X線檢查、骨密度檢查，術(shù)后12周處死動(dòng)物，收集標(biāo)本，分別行生物力學(xué)測定，脫鈣切片、HE染色，不脫鈣切片進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察雙標(biāo)間距，計(jì)算平均礦化率。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，組間差異比較分別采用方差分析和q檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異特別

8、顯著。
　　四、結(jié)果
　　1rhBMP-2/GMs性質(zhì)檢測結(jié)果.
　　形態(tài)及粒徑：經(jīng)圖像分析儀檢測，圓形規(guī)則，直徑為78±20μm，平均直徑為87.8μm。掃描電鏡觀察固化后的微球表面均勻、圓整，微球之間粘連少，分散性好。
　　載藥率及包封率：微球內(nèi)藥物的包封率80.5％，微球載藥率為9.8％，即每毫克微球中含98μg。
　　穩(wěn)定性觀察：明膠微球在放置于4℃的恒溫冰柜6個(gè)月以后，倒置顯微鏡下觀察其外觀、形態(tài)

9、明顯無變化，無明顯粘連，再分散性良好，置于生理鹽水中后成乳狀液，散布均勻，無沉淀。
　　體外釋藥實(shí)驗(yàn):rhBMP-2/GMs微球釋藥結(jié)果表明微球的體外釋藥符合雙相動(dòng)力學(xué)釋藥規(guī)律，即初相為快速釋藥相，后相為平穩(wěn)緩釋相。體外釋藥曲線可見約70％的rhBMP-2在10天左右釋放完成。兩種復(fù)合材料對比釋藥結(jié)果表明：rhBMP-2/GMs/CPC組的24小時(shí)體外釋放率為8.3±1.5％，隨后28天內(nèi)逐漸緩慢釋放，不同時(shí)間點(diǎn)的釋放率均高于rh

10、BMP-2/CPC組。
　　2.rhBMP-2/GMs/CPC體內(nèi)降解、誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)
　　X線檢查：術(shù)后第12周，A組骨缺損修復(fù)明顯快于B組、C組，且材料降解較B組快。骨密度檢測顯示術(shù)后6周三組未見明顯差異，但12周后A組明顯高于B、C組。組織病理學(xué)提示：術(shù)后12周材料周圍、鄰近區(qū)域A組的平均骨礦化率均明顯高于B組及C組。HE染色見術(shù)后12周A組復(fù)合材料大部分降解，內(nèi)部可見大量新生骨組織生成，新生骨組織的形成量明顯高于B組、

11、C組，不脫鈣切片觀察：A組材料骨界面見雙條狀新骨熒光著色帶且距離較寬，新骨生成較多；B組見骨界面材料熒光著色極少，距離最窄；而C組片狀著色且距離相對較窄，說明材料周圍新骨生成相對不穩(wěn)定。
　　五、結(jié)論
　　1．探索出:rhBMP-2/GMs的最佳制備方法，所得方法制備工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。
　　2．rhBMP-2/GMs及rhBMP-2/GMs/CPC體外釋藥實(shí)驗(yàn)均證明其具有良好的緩釋效果。
　　3.rhBMP-2