睪酮時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)試劑及降鈣素原膠體金半定量免疫層析檢測(cè)試劑的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 免疫標(biāo)記技術(shù)指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)（或生物）發(fā)光劑等作為示蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，并借助于熒光顯微鏡、射線測(cè)量?jī)x、酶標(biāo)檢測(cè)儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定的方法。
　　 時(shí)間分辨熒光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是

2、一種靈敏的高端定量免疫檢測(cè)技術(shù)，是以鑭系稀土離子作為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，因鑭系稀土離子具有獨(dú)特的熒光特性，該技術(shù)能夠獲得極高的信噪比，從而具有很高的靈敏度，且還具有標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點(diǎn)。時(shí)間分辨熒光免疫分析相對(duì)于酶免分析、放射免疫分析有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。該技術(shù)適用于各種抗原抗體的臨床檢測(cè)，在市場(chǎng)上已得到廣泛應(yīng)用。
　　

3、 睪酮作為性激素的一種，是臨床激素六項(xiàng)檢測(cè)中的重要組成部分，目前臨床上常用的睪酮檢測(cè)試劑主要是PE公司生產(chǎn)的時(shí)間分辨睪酮檢測(cè)試劑及進(jìn)口的化學(xué)發(fā)光法睪酮檢測(cè)試劑，于是開發(fā)國(guó)產(chǎn)的睪酮檢測(cè)試劑成為我們關(guān)注的焦點(diǎn)。睪酮由于是甾類激素，屬小分子半抗原，98％的睪酮分子在血清中均是以與激素結(jié)合蛋白結(jié)合的狀態(tài)存在，這些特殊性均為睪酮定量檢測(cè)試劑的研發(fā)工作帶來(lái)了困難與挑戰(zhàn)。因此，在睪酮試劑的研制過(guò)程中，我們將異源橋式搭配理念引入研制過(guò)程中，以睪酮的結(jié)

4、構(gòu)類似物雄烯二酮為載體，在其C3位引入含有五個(gè)亞甲基的臂，在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上合成NHS活潑酯，其與BSA偶聯(lián)后進(jìn)行Eu標(biāo)記從而作為反應(yīng)體系中的示蹤物，在以一步間接競(jìng)爭(zhēng)法的模式基礎(chǔ)上研制了此試劑用于血清、血漿中睪酮含量的測(cè)定。
　　 膠體金免疫層析是建立在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、單克隆抗體技術(shù)和免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上的以膠體金為標(biāo)記物，利用特異的抗原抗體反應(yīng)來(lái)放大反應(yīng)，通過(guò)直接觀察就可以判定結(jié)果的新技術(shù)。該技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速

5、、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、激素檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、藥物殘留和毒品快速檢測(cè)諸多診斷領(lǐng)域迅速發(fā)展[1]。隨著即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)產(chǎn)業(yè)的深入發(fā)展，膠體金試劑由于其本身所帶有的快速、簡(jiǎn)便、易于攜帶、便于深入社區(qū)及邊遠(yuǎn)山區(qū)等特點(diǎn)，成為目前POCT發(fā)展的主要領(lǐng)域，從而那些與發(fā)病急、危害大的疾病相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)的膠體金試劑的需求越來(lái)越大。
　　 降鈣素原(PCT)作為一種與膿毒血癥相關(guān)的特異性檢測(cè)指標(biāo)，只有當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)降鈣素原才會(huì)升

6、高，在其他的炎性反應(yīng)中如病毒感染、自身免疫性疾病和創(chuàng)傷等均不會(huì)升高，所以其具有良好的特異性及靈敏度，能用于區(qū)分感染或非感染引起的炎癥、器官功能障礙以及休克。從產(chǎn)生和消除的動(dòng)力學(xué)過(guò)程來(lái)看，PCT也是最適合用作臨床診斷指標(biāo)的。加之膿毒血癥能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)病人的生命造成嚴(yán)重威脅，故其檢測(cè)試劑的膠體金化也成為臨床醫(yī)生及診斷試劑廠家的關(guān)注的重點(diǎn)。但是目前檢驗(yàn)領(lǐng)域僅有幾家公司有相關(guān)試劑的生產(chǎn)能力，國(guó)內(nèi)廠家?guī)缀鯇儆诳瞻谞顟B(tài)，大部分醫(yī)院所使用的相關(guān)檢測(cè)

7、試劑全部依賴進(jìn)口，如Braham公司生產(chǎn)的半定量PCT試劑，但其所具有的一個(gè)重要的缺陷是價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足社區(qū)與邊遠(yuǎn)山區(qū)醫(yī)療需求，故研制國(guó)產(chǎn)的PCT膠體金半定量試劑成為我們的主要目標(biāo)。國(guó)產(chǎn)PCT試劑一直寥寥無(wú)幾的主要原因是沒(méi)有性能優(yōu)越的原料，大部分存在靈敏地低或特異性差的問(wèn)題。為了更好的解決原料問(wèn)題，我們對(duì)市售的PCT抗體進(jìn)行了大規(guī)模的搜索工作，利用時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)進(jìn)行原料配對(duì)等初篩工作，并且發(fā)現(xiàn)了滿足半定量膠體金試劑研發(fā)要求的原料

8、在TRFIA熒光值方面的特殊性，最終通過(guò)雙抗體夾心法研制了能夠進(jìn)行PCT半定量檢測(cè)的膠體金試劑。
　　 本文主要從制備睪酮及睪酮類似物的化學(xué)衍生物及其偶聯(lián)物、睪酮時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑的研究及降鈣素原半定量檢測(cè)試劑的研究共計(jì)三個(gè)方面對(duì)所進(jìn)行的研究做一總結(jié)。
　　 第一部分內(nèi)容中，著重介紹了睪酮及睪酮類似物的化學(xué)衍生物及其偶聯(lián)物的制備，制備過(guò)程以睪酮或睪酮類似物-雄烯二酮作為合成起始原料，向上述結(jié)構(gòu)中引入O-(羧甲基)羥

9、胺半鹽酸鹽(O-(carboxymethyl)hydroxylaminehemi-hydrochloride)或氨氧基已酸氫溴酸鹽(6-Aminooxy-hexanoicacid，hydrobromide)作為臂結(jié)構(gòu)。隨后在NHS及DCC的條件下，攪拌過(guò)夜，將相應(yīng)的肟合成NHS活潑酯結(jié)構(gòu)，利用閃氏柱層析對(duì)其進(jìn)行純化，除去未反應(yīng)的成分。最后將將活潑酯與BSA以摩爾比15∶1的比例進(jìn)行偶聯(lián)，反應(yīng)于室溫下攪拌過(guò)夜，次日以分子篩進(jìn)行純化，并用B

10、CA法分別檢測(cè)四種睪酮偶聯(lián)物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ的濃度分別為0.8 mg/ml、0.9mg/ml、0.9mg/ml及0.8mg/ml。
　　 第二部分著重介紹了人睪酮時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑的研究過(guò)程。首先利用高嶺土、活性炭制備去激素血清作為校準(zhǔn)品配制用基質(zhì)，并配制睪酮校準(zhǔn)品如口下:A(0nmol/L)、B(1.0 nmol/L)、C(3.2nmol/L)、D(6.8nmol/L)、E(14nmol/L)及F(51.2nmol/L

11、)。第二步進(jìn)行睪酮偶聯(lián)物的標(biāo)記，每種偶聯(lián)物都取1mg進(jìn)行標(biāo)記，按照偶聯(lián)物與Eu3+質(zhì)量比2∶1的比例加入銪標(biāo)記配體，標(biāo)記體系均為200μl，將待標(biāo)記偶聯(lián)物和銪標(biāo)記試劑充分混勻后置于搖床上室溫孵育18h。次日過(guò)分子篩層析純化。根據(jù)280 nm蛋白的吸收峰收集洗脫液，即為睪酮檢測(cè)原。利用BCA法檢測(cè)睪酮檢測(cè)原的濃度，然后向其中加入銪標(biāo)保護(hù)液，置-20℃保存。最終檢測(cè)到睪酮檢測(cè)原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ的濃度分別為132μg/ml、135μg/ml、1

12、38μg/ml和140μg/ml。第三步是摸索羊抗鼠IgG的最適包被濃度，設(shè)置包被梯度，用包被液將羊抗鼠IgG多抗稀釋至不同濃度后進(jìn)行，37℃過(guò)夜，封閉，真空抽干，-20℃冷凍保存，檢測(cè)在不同的包被濃度下，睪酮校準(zhǔn)品A的熒光值，通過(guò)熒光值的比較選擇最適的羊抗鼠IgG包被濃度，最終確定羊抗鼠IgG的最適包被濃度為6μg/ml。第四步是進(jìn)行四種睪酮檢測(cè)原的性能比較，根據(jù)各個(gè)睪酮檢測(cè)原的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別確定其ED50，選擇ED50最低的檢測(cè)原作為

13、體系中所使用的示蹤物，最終確定睪酮檢測(cè)原Ⅳ為最佳檢測(cè)原。第五步確定最適的樣本加入量，將樣本加入量做梯度，檢測(cè)在不同加入量條件下的校準(zhǔn)品A的熒光值(Bmax)及校準(zhǔn)品B的熒光值，并計(jì)算B/Bmax的比值，選擇比值相對(duì)較小并且不易對(duì)操作引入誤差的樣本量，最終確定最適樣本加入量為25μl。第六步確定抗睪酮單克隆抗體及檢測(cè)原的最佳使用濃度，將二者的濃度進(jìn)行梯度稀釋，利用棋盤滴定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)靈敏度及A點(diǎn)熒光值來(lái)選擇最適二者最適的稀釋度，最終確

14、定抗睪酮單克隆抗體的最佳使用濃度為6ng/ml，檢測(cè)原的最佳使用濃度為1μg/ml。由于血清中99％的睪酮是以與SHBG（性激素結(jié)合蛋白）相結(jié)合的形式存在，故反應(yīng)緩沖液中阻斷劑的存在對(duì)于血清睪酮含量的準(zhǔn)確測(cè)定具有重要的意義，于是第七步我們進(jìn)行阻斷劑最佳濃度的測(cè)定，將二甲氧雌二醇的濃度做梯度稀釋，根據(jù)不同阻斷劑濃度下A點(diǎn)的熒光值及各個(gè)點(diǎn)的B/Bmax進(jìn)行比較，選擇靈敏度比較高且阻斷劑的加入對(duì)于A點(diǎn)熒光值的影響程度在5％以內(nèi)的濃度為阻斷劑最

15、適使用濃度，最終確定阻斷劑的最適使用濃度為30μg/ml。第八步進(jìn)行最佳反應(yīng)時(shí)間的確定，將反應(yīng)時(shí)間做梯度，檢測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間下校準(zhǔn)品A、B、C、D、E和F的熒光值與Btotal的比值，以各個(gè)校準(zhǔn)品的反應(yīng)都趨于平衡的時(shí)間作為體系的最佳反應(yīng)時(shí)間，最終將最適反應(yīng)時(shí)間定為90分鐘。待試劑的各個(gè)參數(shù)都確定完畢后，對(duì)試劑的整體性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，平行測(cè)定十次校準(zhǔn)品A的熒光值，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，用A點(diǎn)熒光值的平均值減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差，將得到的熒光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，所

16、得的濃度即為分析靈敏度。經(jīng)計(jì)算，分析靈敏度為0.15nmol/L;取不同濃度三個(gè)樣本分別進(jìn)行梯度稀釋，不同稀釋度條件下的測(cè)量濃度與理論濃度的比值即為稀釋回收率，此參數(shù)反映體系的健全性，本試劑的稀釋回收率在98.8％-101.4％之間，稀釋倍數(shù)與含量呈線性關(guān)系，說(shuō)明本分析具有良好的健全性;研究此反應(yīng)的特異性，將臨床上可能與睪酮檢測(cè)有交叉反應(yīng)的各類激素樣本在睪酮檢測(cè)體系中進(jìn)行檢測(cè)，取睪酮體系ED50所對(duì)應(yīng)的睪酮濃度與交叉物質(zhì)在睪酮體系中達(dá)到

17、A點(diǎn)熒光值一半時(shí)的濃度的比值，即為二者之間的交叉反應(yīng)率，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本試劑與孕酮的交叉反應(yīng)率為0.14％，與雙氫睪酮的交叉反應(yīng)率為0.38％，與雌二醇的交叉反應(yīng)率為0.07％，與17-羥基孕酮的交叉反應(yīng)率為0.02％，與雌三醇的交叉反應(yīng)率為0.09％，與Danazol的交叉反應(yīng)率為0.12％;在精密度分析方面，采用三個(gè)伯樂(lè)質(zhì)控品，各設(shè)10個(gè)復(fù)孔，同一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)和不同實(shí)驗(yàn)中重復(fù)多次測(cè)定，分析內(nèi)變異系數(shù)為2.5-6.6％，分析間變異系數(shù)為3.

18、6-7.8％，精密度良好。以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在線性評(píng)估方面應(yīng)用直線回歸分析方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Logit函數(shù)將睪酮的S形競(jìng)爭(zhēng)曲線轉(zhuǎn)換為直線，以此直線的相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)體系的性能，轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)ogit函數(shù)后，線性回歸方程為Y=1.453-2.193X，相關(guān)系數(shù)為r=0.99，R2=1.000，F(xiàn)=7303.334，P＜0.001，說(shuō)明此競(jìng)爭(zhēng)法體系的線性關(guān)系非常好;最后將本試劑與PE試劑做相關(guān)分析，分

19、別對(duì)84例樣本進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)兩種試劑之間的檢測(cè)相關(guān)性，相關(guān)性方程為Y=0.991X-0.331，相關(guān)系數(shù)為r=0.988，R2為0.977，F(xiàn)=3407.808，P＜0.001，說(shuō)明本試劑能夠很好的滿足臨床檢測(cè)的要求。
　　 本論文的第三個(gè)部分主要闡述了降鈣素原膠體金半定量免疫層析檢測(cè)試劑的研制過(guò)程。研制過(guò)程中，首先進(jìn)行NC膜的篩選，對(duì)幾種候選NC膜通過(guò)毛細(xì)管流時(shí)、靈敏度、反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)時(shí)間及試劑條背景等指標(biāo)的比較確定本試劑最終用

20、膜，最終選取Millipore公司生產(chǎn)的HF135作為本試劑用膜;第二步進(jìn)行的是膠體金結(jié)合墊材質(zhì)的篩選，對(duì)候選的膠體金用玻璃纖維通過(guò)材質(zhì)、非特異性吸附、膠體金能否恒定釋放、金標(biāo)墊上膠體金溶解與釋放速度及能否預(yù)防溶血等方面進(jìn)行比較后確定所選取的材質(zhì)，經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，最終確定選擇Millipore的玻璃纖維GFCP103000作為本試劑用的膠體金結(jié)合墊材質(zhì);研制過(guò)程的第三步是原料的篩選過(guò)程，主要是通過(guò)軟件SPSS13.0對(duì)TRFIA數(shù)據(jù)進(jìn)行

21、線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，計(jì)算r值及P值，經(jīng)分析，組合1至組合9均表現(xiàn)為線性性差，r值分別為0.982、0.958、0.973、0.966、0.786、0.859、0.884、0.977及0.458，P值分別為0.003、0.01、0.005、0.007、0.214、0.062、0.047、0.004及0.438，組合10及組合11經(jīng)分析線性性好，r值分別為0.991及0.993，P值均為0.001。其后再利用膠體

22、金方法對(duì)2對(duì)初篩得到的抗體組合進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估，評(píng)價(jià)配對(duì)后的特異性、靈敏度、比色區(qū)分度等指標(biāo)，確定最佳配對(duì)，經(jīng)過(guò)嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)過(guò)程，最終確定使用Hytest的16B5作為包被原料，杭州啟泰的MJG03作為標(biāo)記原料。第四步是對(duì)所確定的標(biāo)記原料進(jìn)行最適標(biāo)記條件的摸索，利用氯化鈉法確定原料的最適標(biāo)記pH值和最適標(biāo)記量，經(jīng)實(shí)驗(yàn)可知，MJG03的最適標(biāo)記pH條件為1ml金中加入0.1M的K2CO315μl，標(biāo)記量為每100ml膠體金溶液

23、標(biāo)記1.5mg。第五步是確定包被用原料的包被條件，通過(guò)設(shè)置不同的包被條件，檢測(cè)在不同包被條件下試劑的靈敏度、特異性、T線顯色程度等指標(biāo)，選擇T線性能最好的條件，最終選擇10mM PBS(pH7.2)作為包被液。第六步進(jìn)行金標(biāo)抗體使用濃度及包被濃度的摸索，通過(guò)將噴金量及包被濃度做梯度，選擇能夠同時(shí)滿足靈敏度高、特異性好且0.5ng/ml、2ng/ml及10ng/ml三個(gè)濃度顯色差異大的組合，經(jīng)過(guò)棋盤滴定法實(shí)驗(yàn)，最終確定金標(biāo)抗體的使用濃度為

24、OD535=40，噴金量為0.5μl/mm，檢測(cè)線抗體16B5的工作濃度為2.5mg/ml，劃線量為0.12μl/mm;質(zhì)控線抗體的最佳工作濃度為1mg/ml，劃線量為0.12μl/mm。在確定最佳噴金量及包被濃度的前提下，第七步進(jìn)行比色卡標(biāo)準(zhǔn)的建立，將0.5ng/ml、2ng/ml及10ng/ml三個(gè)濃度的陽(yáng)性樣本各測(cè)定20次，分別選擇20次結(jié)果的平均顯色度作為比色卡的標(biāo)準(zhǔn)。所有試劑相關(guān)的參數(shù)都確定后，對(duì)試劑性能進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估，通過(guò)測(cè)

25、定檢測(cè)不同降鈣素原濃度的樣本，最終確定試劑的最低檢出量為0.2ng/ml;利用C-反應(yīng)蛋白、降鈣素、類風(fēng)濕因子陽(yáng)性樣本評(píng)價(jià)試劑的特異性，發(fā)現(xiàn)本試劑與10mg/ml的C-反應(yīng)蛋白、6.4mg/ml的降鈣素及500IU/ml的類風(fēng)濕因子均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好;血清血漿樣本檢測(cè)結(jié)果一致性考核方面，將PCT標(biāo)本分別處理成血清、肝素抗凝血漿、EDTA抗凝血漿樣本，確定血清、血漿檢測(cè)結(jié)果是否一致，最終通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)試劑在這兩種樣本的檢測(cè)性能上具有一