小麥抗黃矮病相關(guān)基因片段的克隆.pdf

1、小麥黃矮病(wheat yellow dwarf disease,WYD)是小麥的主要病害之一,由蚜蟲傳播的大麥黃矮病毒(BYDV)引起。小麥黃矮病可引起小麥嚴(yán)重減產(chǎn),因此防治小麥黃矮病對于小麥的穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。目前還沒有能夠有效地防治小麥黃矮病發(fā)生的化學(xué)藥劑,培育抗病品種是防治黃矮病的有效方法。本研究以從小麥品種間雜交組合“川 35050/山農(nóng)483”的F7株系中分離出的抗病和感病株系(近等基因系)為材料,利用改進的DDRT-PCR

2、技術(shù)和同源序列克隆法對抗感材料中的差異基因進行分離,以期找到抗小麥黃矮病相關(guān)基因,并對這些差異表達的cDNA和DNA片段進行克隆、測序和分析。主要結(jié)果如下： (1) 以感、抗小麥黃矮病的2個近等基因系為材料,利用mRNA差異顯示技術(shù)進行PCR擴增。為增強抗病基因片段的篩選,我們根據(jù)抗病基因保守結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計7條簡并或特異引物,并將7條引物代替5'端的隨機引物進行差異顯示擴增。銀染顯色后發(fā)現(xiàn)只有SP5L引物和錨定引物組合能擴增出條

3、帶,我們從擴增的條帶中選擇回收有明顯差異且重復(fù)性好的cDNA片段14條。將14條差異條帶進行克隆測序后,獲得4條差異序列,分別命名為Rbdv1～Rbdv4(GenBank注冊號:EU267934～EU267937)。經(jīng)BlastN比對,這些序列與大麥在幼苗、葉、穗等不同器官生長過程中表達的cDNA克隆有95％的同源性,并與編碼水稻細(xì)胞分裂蛋白48-A的基因和編碼擬南芥細(xì)胞分裂蛋白48-E的基因的同源性分別為90％、81％。 (2

4、) 利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(3'-RACE)擴增Rbdv1的3端的序列,獲得帶有典型的poly(A)尾巴的一條序列,命名為A1,GenBank注冊號為EU267938。對A1的氨基酸序列進行分析,發(fā)現(xiàn)該片段中包含-個磷酸結(jié)合環(huán)(P-Loop),P-Loop是抗病基因保守結(jié)構(gòu)域NBS的其中-個區(qū)域。經(jīng)BlastN同源性比對分析,該片段與不同植物(如擬南芥、水稻等)中的一種細(xì)胞分裂周期相關(guān)的蛋白基因CDC4,8(cell divisi

5、onprotein 48)同源性很高。CDC48是AAA-ATPase基因家族成員之一,其主要功能就是ATP結(jié)合位點(ATP binding site)。利用DNAstar軟件對本文所獲得RACE片段(A1)以及N、L6、RPMI、Pib、RPP8等已知的植物抗病基因的P-Loop區(qū)域序列之間在氨基酸水平上進行聚類分析。結(jié)果表明,雖然都具有相同的抗病基因的特征保守結(jié)構(gòu)域,但該片段卻與以上抗病基因的相關(guān)蛋白并不能聚為一類,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),可

6、能編碼一新的抗病基因蛋白。 (3) 利用抗病基因同源序列克隆法,由7對根據(jù)抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計的簡并或特異引物對抗、感黃矮病株系進行PCR擴增,結(jié)果只有SP5引物對擴增獲得一個RGA片段。將該RGA片段進行克隆測序后,得到一532bp序列。經(jīng)NCBI GenBank進行BlastN同源性比較,結(jié)果顯示,RGA序列與小麥(登錄號:AF320845)、高粱(登錄號:AF052396)等NBS-LRR類抗病同源序列具有較高的同源性,分別為

7、99％、100％,與偏凸山羊草抗病基因V6(登錄號:AF158635)及Cre3抗病類似蛋白Cre3-1、Cre3-2(登錄號:AF281284、AF281285)的同源性均為100％。 (4) 利用TAIL-PCR擴增該RGA片段的側(cè)翼序列,結(jié)果將該序列在5'和3'分別方向上延伸了337bp和726bp,用DNAMAN軟件SequenceAssembly進行拼接獲得長1563bp的序列。分析其氨基酸序列可知,該序列包含一個36