棉花抗枯萎病相關(guān)基因的克隆.pdf

1、目的：棉花枯萎病是一種在世界范圍內(nèi)普遍流行的土傳的真菌性病害，嚴(yán)重影響棉花生產(chǎn)，新疆是我國(guó)唯一的海島棉生產(chǎn)基地，也是我國(guó)海島棉枯萎病流行區(qū)。大量研究表明，選育抗病品種是解決棉花枯萎病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷完善和應(yīng)用為棉花抗枯萎病品種的選育提供了新的途徑。本研究采用cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合RACE技術(shù)，從棉花抗病資源中挖掘抗病相關(guān)基因，研究基因的表達(dá)特性，初步分析基因的功能，為進(jìn)一步闡明棉花抗病的分子機(jī)制及

2、抗枯萎病棉花品種選育奠定基礎(chǔ)。
　　方法：本研究以高抗枯萎病的陸地棉品種中棉所12號(hào)為材料，將材料水培至第三片真葉展平時(shí)進(jìn)行接菌處理，以未接菌材料為對(duì)照，利用cDNA-AFLP技術(shù)獲得差異基因片段，對(duì)差異片段進(jìn)行同源性分析，結(jié)合RACE技術(shù)，獲得基因的全長(zhǎng)cDNA序列；采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行時(shí)空表達(dá)特性分析，并構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體和干擾載體為研究該基因的功能提供基礎(chǔ)條件。
　　結(jié)果：1：本研究利用cDNA-AF

3、LP技術(shù)對(duì)棉花cDNA進(jìn)行差異片段分離，得到94個(gè)差異片段，選取48個(gè)差異片段進(jìn)行克隆及測(cè)序，獲得25條差異片段，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列信息比對(duì)，結(jié)果顯示：21條基因片段在基因庫(kù)中有同源序列，并且已知生物學(xué)功能；3條基因片段在基因庫(kù)中有同源序列但功能未知；1條基因片段在基因庫(kù)中沒(méi)有同源序列。
　　2：通過(guò)對(duì)差異片段的同源性比對(duì)，選取其中一條差異片段，利用RACE技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行全長(zhǎng)克隆，獲得全長(zhǎng)后發(fā)現(xiàn)該基因與NBS-LRR

4、類的抗病基因同源性很高，編碼框全長(zhǎng)為1941bp，編碼647個(gè)氨基酸，分子量為74.08KDa，等電點(diǎn)為5.35。將其命名為GhNBS1。
　　3：通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)該基因在棉花不同器官和不同發(fā)育時(shí)間的表達(dá)進(jìn)行分析，從表達(dá)特征來(lái)看，該基因?qū)γ藁菸【{迫敏感，在棉花根、莖和葉中均表達(dá)，在葉片中表達(dá)量最高，莖中次之，根中表達(dá)量最低。在葉片中基因的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在6h時(shí)達(dá)到高峰，之后降低，在48h時(shí)達(dá)到最低值