羊水來源干細胞的生物學特性分析及其向肝細胞誘導分化的實驗研究.pdf

1、羊水來源干細胞(amniotic fluid—derived stem cells，AFSCs)是近幾年來倍受關(guān)注的新成體干細胞類型，有關(guān)羊水干細胞的分離培養(yǎng)、生物學特性分析、體內(nèi)外分化潛能等仍有很多問題需深入探討。在其誘導分化方向和應用領(lǐng)域方面，我們針對我國肝病的發(fā)病形式和目前肝臟再生修復治療的限制性因素，以分離、培養(yǎng)和鑒定羊水來源干細胞、并將其在體內(nèi)外誘導分化為肝細胞為目標，建立相應的技術(shù)方法，為人類羊水來源干細胞的基礎(chǔ)研究和臨床應

2、用奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究主要包括三部分：
　　 一、AFSCs分離培養(yǎng)方法的建立及生物學特性分析：
　　 孕中期羊水(10-20ml)離心后細胞沉淀分別在下列四種不同條件下進行培養(yǎng)：低糖DMEM培養(yǎng)基(LD)+10％胎牛血清(FBs)、LD+20％胎牛血清、LD+15％胎牛血清+4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、LD+10％胎牛血清+0.1％明膠鋪板。比較不同培養(yǎng)條件下原代集落數(shù)、可傳代次數(shù)、擴增

3、細胞數(shù)等；選擇最佳條件對羊水來源干細胞進行擴增，通過形態(tài)學觀察、細胞周期和生長曲線、特異性標志物檢測、體外誘導分化、染色體核型分析及致瘤實驗等對其生物學特性進行系統(tǒng)分析。
　　 結(jié)果：15％血清結(jié)合bFGF可促進原代羊水細胞的貼壁生長和持續(xù)擴增，在此培養(yǎng)條件下AFSCs生長旺盛，持續(xù)傳代；表達大部分間充質(zhì)來源標志如C0105、CD44、CD29，以及部分全能干細胞標志如SSES-4、Oct-4和Nanog；經(jīng)不同誘導分化條件培養(yǎng)

4、后，從基因表達或表型上證實可向脂肪細胞、神經(jīng)元及成骨細胞等不同胚層的目的細胞分化；長期培養(yǎng)中染色體核型穩(wěn)定，注射裸鼠體內(nèi)后8周未見腫瘤形成。
　　 二、AFSCs向肝細胞誘導分化的體外實驗研究
　　 根據(jù)AFSCs的生物學特點，我們設計了三階段AFSCs向肝細胞誘導分化的策略：二甲基亞砜(DMSO)及表皮生長因子預處理2天一序貫加入成纖維細胞生長因子4(FGF4)、肝細胞生長因子(HGF)誘導分化10天-HGF、制瘤素(

5、0SM)、地塞米松、ITS聯(lián)合繼續(xù)促進成熟10＋天。分別從細胞形態(tài)、肝細胞特定基因表達及肝細胞特殊功能檢測等方面對誘導后細胞進行鑒定。
　　 結(jié)果：誘導后AFSCs形態(tài)由梭形或長梭形逐漸向圓形或多角形轉(zhuǎn)化，RT-PCR可檢測到AFP、Alb、CK18、HNF4β、CYPB1等肝細胞特異基因的表達；免疫熒光法檢測到胞漿內(nèi)AFP及白蛋白的表達。誘導后的細胞能夠攝取，排出靛青綠、貯存糖原、分泌白蛋白。表明AFSCs體外在一定條件下具有

6、分化為有功能肝細胞的能力。
　　 三、AFSCs向肝細胞誘導分化的體內(nèi)研究
　　 以四氯化碳(CCL4)腹腔注射造成裸鼠急性肝損傷模型，尾靜脈注入以熒光染料CFDA-SE標記的未誘導AFSCs。分別于移植后3天、10天、20天處死部分裸鼠，留取肝臟和血液標本，檢測裸鼠肝臟內(nèi)是否有標記細胞分布；同時觀察細胞移植組及對照組肝臟病理及肝功能指標變化。
　　 結(jié)果：移植后3天、10天、20天，裸鼠肝臟內(nèi)均有一定比例的標記

7、細胞，移植后10天標記細胞同時表達出成熟肝細胞標志-白蛋白，提示移植細胞已整合到裸鼠肝臟并分化為肝細胞；HE染色顯示移植AFSCs的裸鼠肝臟損傷愈合過程加快，移植后10天組織學觀察基本恢復正常；而對照組在移植后20天仍有明顯的壞死和炎細胞浸潤灶。
　　 結(jié)論：本文成功建立了孕中期羊水來源干細胞分離培養(yǎng)及向肝細胞誘導分化的技術(shù)體系，表明羊水來源干細胞分離培養(yǎng)簡單，體外擴增及分化能力強，經(jīng)多種細胞因子三階段誘導后，分化為具有肝細胞特