人類胚胎干細胞-誘導性多能干細胞向成熟的嗜堿性粒細胞誘導分化及其生物學特性的研究.pdf

1、人類胚胎干細胞(human embroynic stem cells，hESCs)及人類誘導性多能干細胞(induced human pluripotent stem cells，hiPSCs)具有無限增殖及多向分化潛能，這不僅為再生醫(yī)學研究提供了潛在的細胞來源，而且為建立疾病特異性疾病模型開展研究，以及最終的個體化治療提供了良好的物質基礎。
　　 由hESCs分化而來的造血干細胞已經(jīng)被成功地誘導分化為具有功能的紅細胞、中性粒細

2、胞、血小板、巨核細胞、單核細胞、樹突狀細胞(DC)、自然殺傷細胞(NK)和功能未確定的T、B淋巴細胞，而從hESCs分化誘導嗜堿性粒細胞的相關工作至今尚無報道。嗜堿性粒細胞(basophils)是起源于骨髓多能造血干細胞，在骨髓內分化成熟后進入外周血的一類細胞群。其表型及其部分特性和嗜酸性粒細胞以及肥大細胞相似。嗜堿性粒細胞在介導過敏反應與發(fā)揮免疫調節(jié)作用中具有重要的功能，并且在增強免疫應答記憶等方面發(fā)揮作用。鑒此，探討嗜堿性粒細胞分化

3、發(fā)育途徑涉及調控機制具有重要的理論和研究價值。
　　 嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞均具有相似的細胞表型和功能。這三種細胞的早期發(fā)育至今都存在著爭議。有研究表明，嗜堿性粒細胞早期與嗜酸性粒細胞一起發(fā)育，也有研究認為嗜堿性粒細胞與肥大細胞的早起發(fā)育是一條途徑。因此從hESCs/hiPSCs向嗜堿性粒細胞分化發(fā)育的研究將有助于解決這一科學問題的價值。
　　 鑒此，本研究探索性建立由hESCs/hiPSCs

4、來源的、誘導分化成熟的嗜堿性粒細胞的培養(yǎng)方法，在此基礎上對其生物學功能進行初步探討。
　　 第一部分hESCs/hiPSCs向早期造血干細胞分化及其生物學特性
　　 [目的]建立hESCs/hiPSCs向早期造血干細胞分化的方法，并對hESCs/hiPSCs誘導分化的造血干細胞生物學特性進行比較。
　　 [方法]①從小鼠胚胎中分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維母細胞（mouse embrynicfibroblast，MEF）

5、細胞，體外擴增，并作為滋養(yǎng)層與人類胚胎干細胞系(H1)，人類誘導性多能干細胞(G1、G4、B6、B7)共培養(yǎng)保持其生長和未分化能力。②用未分化的hESCs/hiPSCs分別與小鼠主動脈-性腺-中腎區(qū)(AGM)成纖維細胞共培養(yǎng)，誘導分化成早期造血干細胞。③經(jīng)流式細胞儀檢測分析這幾組誘導分化后的早期造血干細胞表面標志物特征。④經(jīng)PT-PCR檢測hESCs誘導的早期造血干細胞的基因表達。
　　 [結果]①經(jīng)體外分離、消化、傳代培養(yǎng)出大

6、量的MEF細胞，作為hESCs/hiPSCs的滋養(yǎng)層細胞，促使其快速生長繁殖而不分化。②經(jīng)未分化的hESCs/hiPSCs與小鼠AGM成纖維細胞共培養(yǎng)誘導14d后，可以成功誘導出大量的早期造血干/祖細胞。③通過流式檢測分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)本實驗誘導培養(yǎng)的早期造血干/祖細胞具有向紅系、內皮系、髓系等細胞分化的能力，進一步證實了本實驗所采用培養(yǎng)方法能大量有效誘導出早期二次造血干/祖細胞。④經(jīng)過RT-PCR的檢測發(fā)現(xiàn)本實驗的誘導培養(yǎng)方法早在共培養(yǎng)階段

7、就可以檢測到早期造血調控所必須的基因CD34、c-kit、GATA-1的表達，進一步證實了本方法誘導培養(yǎng)出早期造血干/祖細胞的有效性。
　　 [結論]通過hESCs/hiPSCs與小鼠AGM成纖維細胞共培養(yǎng)方法可以大量、有效地誘導出早期的二次造血干細胞。
　　 第二部分hESCs/hiPSCs向成熟嗜堿性粒細胞誘導分化及生物學特性
　　 [目的]建立人類胚胎干細胞/誘導性多潛能干細胞向嗜堿性粒細胞分化的方法，并鑒

8、定其極其生物學特性。探討由人類胚胎干細胞經(jīng)分化得到的嗜堿性粒細胞的趨化能力及釋放組胺功能。
　　 [方法]①經(jīng)過不同細胞因子的三階段的誘導法得到一定量的含有堿性顆粒的粒細胞。②通過光學顯微鏡觀察，對細胞的增殖進行計算統(tǒng)計;利用May-Giemasa、Toluidine blue染色對細胞大體形態(tài)染色觀察;免疫熒光染色對其細胞顆粒進行特異性的染色，并且將其與嗜酸性粒細胞作比較，證實所誘導的細胞為嗜堿性粒細胞。③通過FACS和半定量

9、RT-PCR對培養(yǎng)的細胞進行表型和基因檢測，同時用嗜酸性粒細胞作為對照進行比較性研究。④用不同濃度的N-甲?；琢蝓?亮氨酰-苯丙氨酰胺( fMLP)，嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)，F(xiàn)cεRI(CRA-1)置于transwell板下室，觀察細胞嗜堿性粒細胞的趨化能力，并且與嗜酸性粒細胞進行比較研究。⑤用不同濃度的fMLP，eotaxin、FcεRI(CRA-1)置于transwell板下室，觀察嗜堿性粒細胞的趨化能力，并且與嗜

10、酸性粒細胞進行比較研究。⑥用不同濃度的FcεRI(CRA-1)在液體培養(yǎng)第14天與第21天刺激嗜堿性粒細胞，收集上清，并裂解細胞，收集細胞內含有的因子。用ELISA檢測試劑盒檢測胞內和分泌組胺量，并算出組胺釋放率。
　　 [結果]①經(jīng)過誘導培養(yǎng)3天后開始大量增殖，7天開始增殖速度明顯加快，一般在兩周達到細胞增殖的高峰，兩周后鏡下觀察，細胞呈不規(guī)則且顆粒粗大。②May-Giemasa染色可見大約21.4％的細胞呈現(xiàn)胞體不規(guī)則形，胞

11、漿胞內可見粗大的藍紫色顆粒，胞核為單核或者分葉兩葉核;約41.9％的細胞胞內含有紫紅色的異染顆粒;免疫熒光染色可見此類細胞，胞內顆粒表達2D7但不表達EPO，高表達ProMBP,而低表達MBP。③hiPSCs來源細胞向嗜堿性粒細胞誘導后，2D7+/EPO-的細胞比例遠高于hESCs(H1)來源的細胞;ProMBP陽性率高于hESCs，而MBP陽性率卻比hESCs低。④通過FACS分析，發(fā)現(xiàn)細胞表面有嗜堿性粒細胞特異性標志的表達，并且RT

12、-PCR的檢測也證實這些細胞不含有嗜酸性粒細胞的基因。⑤趨化實驗發(fā)現(xiàn)，嗜堿性粒細胞比嗜酸性粒細胞的趨化功能更強。⑥嗜堿性粒細胞能有效地釋放組胺，而且在液體培養(yǎng)第21天的釋放量比第14天多。
　　 [結論]通過細胞因子的三步誘導方法可以從hESCs成功有效地誘導得到一定比例的成熟的嗜堿性粒細胞，并且在hiPSCs的誘導實驗中也得到了驗證。此嗜堿性粒細胞具有其特有的趨化功能，并且經(jīng)FcεRⅠ刺激能釋放組胺。本研究證實了該誘導方法可靠