臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及其多向誘導(dǎo)分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討影響人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSCs)成功分離培養(yǎng)的相關(guān)因素及其生物學(xué)特性，并對(duì)其向成骨、成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力進(jìn)行研究。 方法： (1)分別從不同胎齡（≥40周、37周和≤32周）、臍血中單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)的數(shù)量(≥2.5×109/L、<2.5×109/L)、不同細(xì)胞接種密度(1×104 cells/ml、1×106 cells/ml、1×108 cells/ml)、不同胎牛血清(FBS)濃度(5％

2、、10％、15％、20％)以及培養(yǎng)瓶是否被FBS包被等方面對(duì)UCB-MSCs的分離培養(yǎng)成功率進(jìn)行分析比較；通過(guò)倒置相差顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖情況及其超微結(jié)構(gòu)；并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；計(jì)算并分析比較不同胎齡組UCB-MSCs的集落形成能力和細(xì)胞倍增時(shí)間差異：用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。 (2)分別用成骨及成脂誘導(dǎo)液對(duì)UCB-MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)茜素紅染色、堿性磷酸酶染色及活性測(cè)定等檢測(cè)UCB-MSCs向成

3、骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力；通過(guò)油紅O染色檢測(cè)其向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力。 結(jié)果： (1) UCB-MSCs的分離培養(yǎng)成功率為58.3％，且不同胎齡組培養(yǎng)成功率隨胎齡的增高而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( X2=9.87，P=0.007)；臍血中MNCs含量在2.5×109/L以上者培養(yǎng)成功率高達(dá)76.9％，與MNCs含量低于2.5×109/L組(36.4％)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( X2=8.07，P=0.005)；相同容量的臍血

4、中MNCs與胎齡的相關(guān)性分析顯示，兩者呈負(fù)相關(guān)(n=20，r=-0.95，P<0.01)；在接種密度低于1×108 cells/ml組中，原代及傳代培養(yǎng)的MSCs生長(zhǎng)及擴(kuò)增情況均不如1×108 cells/ml組；FBS濃度為5％組與10％、15％、20％組相比，MSCs貼壁速度略慢，但MSCs的純度較高，破骨樣細(xì)胞含量明顯要少，后三組之間未見(jiàn)明顯差別，且5％FBS濃度組細(xì)胞傳代速度與其他三組相比無(wú)明顯差別；用FBS對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行包被后，

5、UCB-MSCs不僅在原代和傳代后的純度增加了，而且其擴(kuò)增能力也明顯快于未包被組。倒置相差顯微鏡下觀察UCB-MSCs貼壁生長(zhǎng)，呈成纖維細(xì)胞樣外觀，細(xì)胞呈螺旋狀排列；透射電鏡觀察UCB-MSCs細(xì)胞核大，胞核比例大，細(xì)胞器少，為低分化細(xì)胞；原代及傳代培養(yǎng)的UCB-MSCs生長(zhǎng)曲線均呈S型，第3、5代細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)；3個(gè)不同胎齡組的UCB-MSCs集落形成能力存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=8.53，P<0.05)，低胎齡組集落形成能力大于高胎齡組

6、；不同胎齡的UCB-MSCs細(xì)胞群體倍增時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.68，P>0.05)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，UCB-MSCs均穩(wěn)定的表達(dá)與MSCs相關(guān)的表面抗原標(biāo)志物CD29、CD44和CD90等，不表達(dá)造血標(biāo)志CD34和CD45。 (2) UCB-MSCs成骨誘導(dǎo)后ALP活性逐漸增強(qiáng)，3周時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞ALP染色強(qiáng)陽(yáng)性、茜素紅染色可檢測(cè)到大量鈣化基質(zhì)的形成；成脂誘導(dǎo)3周時(shí)油紅O染色可檢測(cè)到胞質(zhì)中脂滴的形成。 結(jié)

7、論： (1)不同胎齡的臍血中均含有MSCs，其分離培養(yǎng)成功率受多種因素的影響；通過(guò)選擇較低胎齡的胎兒、采集足夠量的臍血、以較高的細(xì)胞密度接種、培養(yǎng)基中添加較低濃度的FBS、并將培養(yǎng)瓶預(yù)先用FBS進(jìn)行包被、且在細(xì)胞培養(yǎng)的適當(dāng)時(shí)機(jī)進(jìn)行換液和傳代等，能在體外建立穩(wěn)定的UCB-MSCs培養(yǎng)體系。 (2) UCB-MSCs的形態(tài)特征、生長(zhǎng)增殖特點(diǎn)及細(xì)胞表面標(biāo)志物等生物學(xué)特性與骨髓MSCs相似，具有強(qiáng)大的生長(zhǎng)增殖與自我更新能力。