microRNA在乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷和羊水干細(xì)胞肝向分化中的作用研究.pdf

1、前言：
　　酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的全球性疾病，包括脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化，并可能最終引起肝腫瘤。普遍認(rèn)為，在ALD的發(fā)病過(guò)程中，由于體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生與清除不平衡而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激發(fā)揮關(guān)鍵作用。乙醇可能通過(guò)增加ROS的產(chǎn)生和/或降低抗氧化酶的活性促進(jìn)氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)酒精性肝損傷;然而，其具體分子機(jī)制尚不完

2、全清楚。近年來(lái)，微小RNA(microRNA，miRNA)在人類(lèi)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關(guān)注。miRNA是一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過(guò)降解靶mRNA或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。有學(xué)者報(bào)道乙醇可能通過(guò)調(diào)控miRNA表達(dá)進(jìn)而參與ALD;然而，這些miRNA在酒精性肝損傷中的具體致病機(jī)制仍不明確。
　　本研究第一部分?jǐn)M根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析結(jié)果，著重圍繞兩個(gè)關(guān)鍵的抗氧化酶基因——谷胱甘肽還原酶(Gluta

3、thione，GSR)基因和細(xì)胞色素P450還原酶(Cytochrome P450 Oxidoreductase，POR)基因;通過(guò)載體構(gòu)建和熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩查可能與這兩個(gè)基因3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)靶向結(jié)合的miRNA;通過(guò)Western blot和抗氧化酶活檢測(cè)試劑盒，鑒定這些miRNA對(duì)GSR和POR蛋白表達(dá)以及酶活性的影響;并通過(guò)乙醇處理體外培養(yǎng)肝細(xì)胞和酒精喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠，應(yīng)用Realtime PCR、Western

4、blot和氧化應(yīng)激檢測(cè)試劑盒等方法，明確該調(diào)控途徑在酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。
　　此外，干細(xì)胞作為一類(lèi)具有自我復(fù)制和多向分化潛能的未成熟細(xì)胞，由于其在一定條件下可分化成為多種成體功能細(xì)胞，具有再生人體各種器官組織的潛在能力，因此可成為肝細(xì)胞損傷后修復(fù)研究的熱點(diǎn)。羊水干細(xì)胞是介于胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞之間的一種特殊干細(xì)胞，沒(méi)有胚胎干細(xì)胞的致瘤性，也避免倫理道德問(wèn)題，同時(shí)又比成體干細(xì)胞更有活力，易于誘導(dǎo)成各胚層細(xì)胞，可被視為一

5、種新型“治療細(xì)胞”。
　　目前，AFS體外肝向誘導(dǎo)分化常規(guī)誘導(dǎo)方法具體機(jī)制仍不完全清楚，且操作步驟繁瑣，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，成本高，不利于轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。因此，本研究第二部分?jǐn)M通過(guò)培養(yǎng)大鼠羊水細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選多潛能干細(xì)胞標(biāo)志Oct4陽(yáng)性細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證Oct4，并對(duì)所獲得的細(xì)胞克隆經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定其細(xì)胞表面其他干細(xì)胞標(biāo)記蛋白以及經(jīng)試劑盒檢測(cè)端粒酶活性，以保證成功分離AFS;并在此基礎(chǔ)上，以O(shè)ct4為切入點(diǎn)，鑒定調(diào)

6、控其基因表達(dá)的關(guān)鍵microRNA，并初步探討該調(diào)控途徑在誘導(dǎo)AFS向肝細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，以期創(chuàng)建干細(xì)胞肝向分化新策略，為將來(lái)肝細(xì)胞損傷修復(fù)的細(xì)胞治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料:
　　1、人類(lèi)肝癌Bel7402細(xì)胞、人胚腎HEK293細(xì)胞、大鼠正常肝細(xì)胞BRL、Wistar大鼠、大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2
　　2、microRNA模擬物及抑制劑等相關(guān)試劑
　　3、Realti

7、me PCR相關(guān)試劑
　　4、RT-PCR相關(guān)試劑
　　5、基因克隆及熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相關(guān)分子生物學(xué)試劑
　　6、Western印跡相關(guān)試劑
　　7、GSR POR酶活性檢測(cè)試劑
　　8、氧化應(yīng)激損傷檢測(cè)試劑盒
　　9、流式細(xì)胞分選相關(guān)試劑
　　10、Oct4陽(yáng)性細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化肝臟細(xì)胞相關(guān)試劑
　　二、實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)GSR、POR及Oct4靶向調(diào)控mi

8、croRNA。
　　2、PCR克隆構(gòu)建GSR、POR及Oct4的3'非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)熒光素酶報(bào)告基因載體，以及相關(guān)microRNA過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證microRNA靶向調(diào)控作用。
　　3、通過(guò)對(duì)Bel7402、BRL轉(zhuǎn)染microRNA過(guò)表達(dá)載體，以及應(yīng)用microRNA抑制劑，通過(guò)Western印記正反向驗(yàn)證microRNA靶向調(diào)控GSR與POR表達(dá)。

9、>　　4、適量乙醇刺激Bel7402細(xì)胞與BRL細(xì)胞，Realtime PCR檢測(cè)GSR、POR相關(guān)microRNA表達(dá)情況，Western blot檢測(cè)GSR、POR蛋白表達(dá)水平。
　　5、長(zhǎng)期乙醇飼喂Wistar大鼠，并分別于0天、1天、1周、2周、3周、4周獲取肝臟組織，Realtime PCR檢測(cè)其GSR、POR對(duì)應(yīng)microRNA表達(dá)情況，Western blot檢測(cè)GSR、POR蛋白表達(dá)水平，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證乙醇誘導(dǎo)氧

10、化應(yīng)激損傷機(jī)制。
　　6、獲取Wistar大鼠孕16.5天子宮，抽取羊水原代培養(yǎng)，并采取極限稀釋法獲得若干細(xì)胞克隆，凍存并同時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)50代以上，流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選Oct4陽(yáng)性細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，獲得克隆，Westernblot檢測(cè)Oct4。
　　7、流式細(xì)胞分選技術(shù)及免疫熒光檢測(cè)羊水干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29，34，44，90，105等。
　　8、端粒酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)獲得細(xì)胞克隆端粒酶活性，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、肝組

11、織細(xì)胞及肝細(xì)胞系為對(duì)照。
　　9、應(yīng)用H9C2細(xì)胞作為Oct4內(nèi)源性細(xì)胞系，驗(yàn)證前述microRNA調(diào)控Oct4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　10、通過(guò)條件培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)的方法，連續(xù)培養(yǎng)45天，并獲取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組蛋白及RNA。
　　11、Realtime PCR方法檢測(cè)肝向誘導(dǎo)后誘導(dǎo)劑對(duì)Oct4相關(guān)的microRNA的調(diào)控作用以及肝臟細(xì)胞標(biāo)志蛋白mRNA，以及Western blot檢測(cè)相應(yīng)Oct4蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

12、
　　1、生物信息學(xué)方法，分別預(yù)測(cè)可靶向調(diào)控GSR、POR、Oct4的microRNA，其中共同調(diào)控GSR與POR的microRNA為miR-214，miR-324，miR-371-3p，miR-619;調(diào)控Oct4的microRNA為miR-24，miR-138，miR-339，miR-3657等。
　　2、雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-214明顯抑制pGL3-GSR與pGL3-POR熒光素酶活性((28％，P=

13、0.004;30.9％，P=0.006)，miR-324抑制作用不明顯，結(jié)果證明了miR-214作用位點(diǎn)位于GSR與POR3'-UTR區(qū)。
　　3、miR-214過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Bel7402和BRL細(xì)胞，Western印記結(jié)果顯示，GSR、POR蛋白表達(dá)水平被明顯抑制，而同時(shí)應(yīng)用miR-214特異性抑制劑可恢復(fù)GSR、POR蛋白水平。結(jié)果表明，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-214靶向調(diào)控GSR、POR。
　　4、乙醇刺激Bel7

14、402細(xì)胞與BRL細(xì)胞后，誘發(fā)肝臟細(xì)胞抗氧化能力下降，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷;Realtime PCR結(jié)果顯示，miR-214上升3.72倍，miR-324上升2.56倍;同時(shí)Western結(jié)果顯示，GSR、POR蛋白表達(dá)隨乙醇刺激濃度與作用時(shí)間成下降趨勢(shì)。表明乙醇上調(diào)了microRNA，同時(shí)miR靶蛋白GSR與POR表達(dá)受抑制。
　　5、乙醇長(zhǎng)期飼喂Wistar大鼠，肝臟組織mRNA Realtime結(jié)果顯示，miR-214水平隨

15、乙醇攝入時(shí)間成明顯上升趨勢(shì)，同時(shí)Western blot結(jié)果顯示，GSR蛋白表達(dá)隨乙醇攝入時(shí)間成明顯下降趨勢(shì)，POR蛋白除攝入1周時(shí)間點(diǎn)呈略升高，其余各時(shí)間點(diǎn)變化趨勢(shì)同GSR一致。
　　6、通過(guò)極限稀釋法成功獲得若干高增殖效率細(xì)胞克隆，流式細(xì)胞分選技術(shù)，成功獲得Oct4陽(yáng)性目標(biāo)克隆，流式細(xì)胞篩選證明細(xì)胞克隆為CD29，CD44等陽(yáng)性，并通過(guò)凍存復(fù)蘇證明細(xì)胞克隆可反復(fù)凍存利用;端粒酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，獲得Oct4陽(yáng)性克隆端粒酶明顯高于肝

16、組織細(xì)胞及肝細(xì)胞系，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相當(dāng)，證明所得細(xì)胞確實(shí)為羊水干細(xì)胞。
　　7、應(yīng)用復(fù)合誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)，檢測(cè)誘導(dǎo)后肝細(xì)胞標(biāo)志蛋白mRNA出現(xiàn)，miR-339表達(dá)顯著升高，Oct4表達(dá)顯著降低，提示誘導(dǎo)劑通過(guò)上調(diào)miR-339表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)下調(diào)Oct4表達(dá)，使細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化。
　　結(jié)論：
　　1、miR-214靶向結(jié)合于GSR和POR基因的3'-UTR，并抑制GSR和POR蛋白表達(dá)和活性。