PARP-1抑制劑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及其聯(lián)合順鉑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用.pdf

1、第一部分
　　 目的:探討PARP-1 抑制劑3-aminobenzamide(3-AB)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS 及MG63 增殖及凋亡的影響。
　　 方法:
　　 1.用含10％胎牛血清的McCoy's 5a Medium Modified 培養(yǎng)基培養(yǎng)U2OS細(xì)胞，含10％胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，鋪滿瓶底后傳代；
　　 2.將U2OS細(xì)胞種于96 孔板，設(shè)6組：空白組、對(duì)照組、5mM

2、 3-AB 刺激組、10 mM3-AB 刺激組、15mM 3-AB 刺激組、20mM 3-AB 刺激組，每組4個(gè)復(fù)孔，種3塊板，分別給予刺激24、48、72 h，按CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖，計(jì)算抑制率；
　　 3.將MG-63細(xì)胞種于96 孔板，設(shè)5組：空白組、對(duì)照組、5mM 3-AB 刺激組、10 mM3-AB 刺激組、20mM 3-AB 刺激組，每組4個(gè)復(fù)孔，種3 塊板，分別給予刺激24h、48h、72 h，按CCK-8

3、法檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率；
　　 4.將U2OS細(xì)胞種于6 CM 培養(yǎng)皿中，接種6個(gè)皿，其中3 皿作為對(duì)照組給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，另3 皿在培養(yǎng)基中加入10mM的3-AB，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后每組各取一皿，按Annexin V-FITC 凋亡試劑盒說明書操作，上流式細(xì)胞儀測(cè)凋亡率；
　　 5.將MG-63細(xì)胞種于6 CM 培養(yǎng)皿中，接種8個(gè)皿，其中2 皿作為對(duì)照組給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，另6 皿在培養(yǎng)基

4、中分別加入5mM、10mM、20mM的3-AB，在培養(yǎng)24h、48h后每組各取一皿，按Annexin V-FITC 凋亡試劑盒說明書操作，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；
　　 6.將U2OS細(xì)胞種于6CM的培養(yǎng)皿中，接種4個(gè)皿，其中一皿作為對(duì)照組，另三皿分別給予10mM的3-AB 刺激8h、12h、24h后，按caspase-3 活性測(cè)定試劑盒說明書提取蛋白測(cè)定caspase-3的活性；
　　 7.將U2OS細(xì)胞種于6CM

5、的培養(yǎng)皿中，接種4個(gè)皿，一皿作為對(duì)照，給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，另三皿培養(yǎng)基中加入10mM的3-AB，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后提取細(xì)胞總蛋白，Western-blotting 檢測(cè)Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.3-AB 抑制骨肉瘤細(xì)胞U2OS的增殖，抑制率隨3-AB 濃度的升高而升高，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；
　　 2.3-AB 抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63的增殖，抑制率隨3-AB 濃度的升高而升

6、高，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；
　　 3.3-AB 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞U2OS的凋亡，凋亡率隨3-AB 刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；
　　 4.3-AB 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞MG-63的凋亡，凋亡率隨3-AB 濃度的升高而升高，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；
　　 5.3-AB 刺激8h、12h后caspase-3 活性增加，差異有顯著性，24h后caspase-3 活性與對(duì)照組比較無顯著性差異；
　　 6.3-AB 刺激24h、48h

7、、72h后，Bax表達(dá)量逐漸升高，Bcl-2表達(dá)量則在24h 及48h輕度升高，72h 降低。
　　 結(jié)論:PARP-1 抑制劑3-AB 能抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。
　　 第二部分
　　 目的:探討PARP-1 抑制劑3-aminobenzamide(3-AB)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS 遷移及侵襲的影響。
　　 方法:
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)U2OS細(xì)胞，鋪滿瓶底后傳代；
　　 2.將U

8、2OS細(xì)胞種于6 孔板中，待細(xì)胞鋪滿孔底后用槍頭在孔板底劃三道劃痕，PBS沖洗三次，然后將孔分為3組，分別給予完全培養(yǎng)基、含5mM 3-AB的培養(yǎng)基和含10mM 3-AB的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24h后觀察細(xì)胞遷移的距離；
　　 3.將U2OS細(xì)胞分為兩組，一組為對(duì)照組，給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，另一組給予10mM3-AB 處理24h，然后將細(xì)胞消化后重懸于含0.1％ BSA的無血清培養(yǎng)基中，加入鋪好matrigel的Transwell 小

9、室的上室，下室加入完全培養(yǎng)基，24h后棉棒除去基質(zhì)膠，染色，顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 1.3-AB 刺激后較對(duì)照組細(xì)胞遷移距離降低，且隨3-AB 濃度增加，遷移距離降低越明顯，差異有顯著性；
　　 2.3-AB 刺激后較對(duì)照組細(xì)胞穿過基底膜數(shù)量減少，差異有顯著性。
　　 結(jié)論:
　　 PARP-1 抑制劑3-AB 能抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力。
　　 第三部分<

10、br>　　 目的:探討PARP-1 抑制劑3-aminobenzamide(3-AB)聯(lián)合順鉑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS 生長(zhǎng)的影響。
　　 方法:
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)U2OS細(xì)胞，鋪滿瓶底后傳代；
　　 2.將U2OS細(xì)胞接種于兩塊96 孔板中，分為順鉑處理板及順鉑聯(lián)合3-AB 處理板，每板設(shè)七組，分別為空白組、對(duì)照組、0.5μg/ml 順鉑加或不加3-AB組、1.0μg/ml順鉑加或不加3-AB組、1.5μg/m

11、l 順鉑加或不加3-AB組、2.0μg/ml 順鉑加或不加3-AB組、2.5μg/ml 順鉑加或不加3-AB組，分別在刺激48h后用CCK-8 法測(cè)吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率；
　　 3.將U2OS細(xì)胞接種于6CM 皿中，接種12個(gè)皿，分為4組：陰性對(duì)照組、3-AB 處理組、順鉑處理組、3-AB 聯(lián)合順鉑處理組，每組3 皿，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后收集細(xì)胞，PI 染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化。

12、　　 結(jié)果:
　　 1.單純順鉑處理及與3-AB 聯(lián)合處理后細(xì)胞的存活率均隨順鉑濃度的增高而逐漸降低，單純順鉑處理IC50 為1.15003，聯(lián)合刺激組的IC50 為0.65254，增敏比為1.76；
　　 2.與對(duì)照組比較，經(jīng)單純3-AB 處理，及3-AB與順鉑聯(lián)合處理后細(xì)胞的凋亡率均增加，而3-AB 聯(lián)合順鉑處理后細(xì)胞的凋亡率較單純3-AB 及單純順鉑處理的凋亡率高；
　　 3.與對(duì)照組比較，3-AB 處理