靶向cyclinA2基因的小干擾RNA對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用.pdf

1、骨肉瘤是骨的原發(fā)惡性腫瘤,約占20歲以下人群惡性骨腫瘤總數(shù)的60﹪,其惡性程度高并極易復發(fā)和轉移,發(fā)病原因尚不清楚.目前對骨肉瘤的治療通常采用手術結合新輔助化療的方法,但由于腫瘤耐藥、轉移等原因使治療結果并不能令人滿意,骨肉瘤患者的生存率已進入了平臺期,如何進一步提高骨肉瘤的療效并在根本上對其進行治療是亟待解決的問題.細胞周期調控異常與腫瘤發(fā)生密切相關,各種致瘤因素最終導致細胞周期紊亂,增殖異常而誘發(fā)腫瘤,故腫瘤本質上是一種細胞周期病.

2、在骨肉瘤中同樣也存在著細胞周期的調節(jié)失控.周期蛋白依賴激酶 (Cdks) 的時相性激活是細胞周期調控機制的核心,它通過對相應的底物磷酸化,驅使著細胞完成細胞周期,而周期蛋白(cyclins)是調控Cdks活性的最基本成分,周期蛋白表達量及活性的波動直接決定著Cdks的活性狀態(tài).作為Cdk1及Cdk2的調節(jié)亞基,周期蛋白 A2 (cyclinA2) 起始并控制著DNA的復制,對細胞DNA合成期(S期)、有絲分裂期(M期)的進程以及G1/S

3、期、G2/M期的轉換至關重要.有證據(jù)表明 cyclinA2 具有癌基因活性,其反常增多與細胞的惡性轉化密切相關.同時cyclinA2也是多種癌基因促使細胞惡性轉化進程中的關鍵靶點,如致癌基因c-Fos可通過cyclinA2的失控表達使成骨細胞惡性轉化并發(fā)展為骨肉瘤.目前在多種癌變組織包括骨肉瘤中發(fā)現(xiàn)cyclinA2蛋白的高表達或過表達,而在正常組織細胞中低表達或不表達.臨床研究顯示cyclinA2高表達與骨肉瘤的不良預后密切相關.這些證

4、據(jù)均提示抑制或消除cyclinA2在骨肉瘤細胞中的表達有可能成為骨肉瘤治療的一個有效策略. PuNA干擾(RNAi)是廣泛存在于真核生物中的特定基因轉錄后沉默機制,其作用機理是通過細胞內的核酸內切酶Dicer將進入細胞的長雙鏈RNA(dsRNA)剪切成20bp左右的短雙鏈RNA片斷,然后這些短雙鏈RNA的單鏈與RNA誘導沉默復合體(RISC)結合,指導RISC結合并剪切靶mRNA以達到特定基因沉默的作用.這些長20bp左右的短

5、雙鏈RNA片斷被稱為小干擾RNA(siRNA),它是RNA干擾機制的核心.sirNA基因沉默技術克服了傳統(tǒng)反義核酸策略的諸多缺陷,是目前為止發(fā)現(xiàn)的最為強勁且最有前途的基因抑制方法.但siRNA的特異性及抑制效率也會被一些因素所影響,如何避免這些因素的干擾是應用此項技術不可回避的問題. 本研究首先針對cyclinA2基因設計并合成三對不同序列的siRNA,靶向骨肉瘤細胞MG-63及正常人成纖維細胞HSF的cyclinA2基因進行沉

6、默,通過在不同時間點檢測三對不同序列siRNA作用下兩種細胞cyclinA2的表達,選擇出基因抑制效率最高的siRNA序列,同時確定最佳抑制濃度及時間.然后用篩選出的siRNA特異性的抑制骨肉瘤細胞MG-63及正常人成纖維細胞HSF內cyclinA2的表達,通過檢測兩種細胞增殖活性、細胞周期、平板克隆形成能力及相關基因表達的變化,探討cyclinA2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的地位,以及能否作為新的基因靶點應用于骨肉瘤的治療. 第一部分

7、:不同序列的cyclinA2-siRNA對骨肉瘤及成纖維細胞cyclinA2基因的沉默作用 目的:研究三對不同序列的siRNA對骨肉瘤細胞MG-63及正常人成纖維細胞HSF@cyclinA2基因mRNA及蛋白表達的抑制作用,挑選最佳抑制序列并確定最適抑制濃度及時間. 方法:設計并化學合成三對靶向cyclinA2基因的siRNA:siRNA<,1>、siRNA<,2>和siRNA<,3>,同時設計并合成一對與任何基因無同源

8、性的無義siRNA.用質脂體Lipofectamine<'TM>2000將各組siRNA分別轉染骨肉瘤MG-63細胞及正常成纖維細胞HSF,以磷酸緩沖液PBS替代siRNA進行轉染作為空白對照,以無義siRNA轉染作為陰性對照.除劑量實驗中濃度梯度為1nM、10nM、50nM,100nM外,其余實驗均轉染50nM濃度的siRNAs.分別用熒光實時定量PCR、western-blot檢測cyclinA2 mRNA及蛋白表達的沉默效果.

9、 結論 1.3對cyclinA2-siRNA均能抑制骨肉瘤及成纖維細胞中 cyclinA2 基因的表達,其中siRNA1抑制效率高于另外2對. 2.siRNA<,1>在轉染后48h基因抑制效率最高并在50nM濃度以下存在著劑量依賴性,高于50nM濃度其基因抑制效率并無明顯增加. 3.選取化學合成的siRNA并以低濃度進行細胞轉染是防止siRNA脫靶效應及非特異效應產生的有效措施. 第二部分:沉默c

10、yclinA2基因對骨肉瘤及成纖維細胞增殖的影響 目的:研究沉默cyclinA2基因的表達對骨肉瘤細胞MG-63及正常人成纖維細胞HSF的生長影響,探討cyclinA2在骨肉瘤細胞增殖中的作用及抑制其表達作為骨肉瘤治療方法的可行性. 方法:用Lipofectamine<'TM>2000將siRNA<,1>分別轉染骨肉瘤MG-63細胞及正常成纖維細胞HSF.MG-63細胞轉染10nM及50nM兩種濃度的siRNA<,1>,

11、HSF細胞只轉染50nM濃度的siRNA<,1>.以PBS替代siRNA進行轉染作為空白對照,對照組轉染50nM無義siRNA.采用四唑鹽比色法(MTT)評價細胞的增殖活性.流式細胞(FCM)周期檢測評價細胞周期分布的改變.RT-PCR評價cyclinB1及PCNA基因表達的變化.轉染后繼續(xù)培養(yǎng)14～18天,平板克隆培養(yǎng)法觀察細胞克隆形成情況. 結論 1. 降低cyclinA2基因的表達能有效抑制骨肉瘤細胞的增殖,導致其