靶向cyclinA2基因的小干擾RNA對骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用.pdf

1、骨肉瘤是骨的原發(fā)惡性腫瘤,約占20歲以下人群惡性骨腫瘤總數(shù)的60﹪,其惡性程度高并極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,發(fā)病原因尚不清楚.目前對骨肉瘤的治療通常采用手術(shù)結(jié)合新輔助化療的方法,但由于腫瘤耐藥、轉(zhuǎn)移等原因使治療結(jié)果并不能令人滿意,骨肉瘤患者的生存率已進(jìn)入了平臺期,如何進(jìn)一步提高骨肉瘤的療效并在根本上對其進(jìn)行治療是亟待解決的問題.細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),各種致瘤因素最終導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂,增殖異常而誘發(fā)腫瘤,故腫瘤本質(zhì)上是一種細(xì)胞周期病.

2、在骨肉瘤中同樣也存在著細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控.周期蛋白依賴激酶 (Cdks) 的時相性激活是細(xì)胞周期調(diào)控機制的核心,它通過對相應(yīng)的底物磷酸化,驅(qū)使著細(xì)胞完成細(xì)胞周期,而周期蛋白(cyclins)是調(diào)控Cdks活性的最基本成分,周期蛋白表達(dá)量及活性的波動直接決定著Cdks的活性狀態(tài).作為Cdk1及Cdk2的調(diào)節(jié)亞基,周期蛋白 A2 (cyclinA2) 起始并控制著DNA的復(fù)制,對細(xì)胞DNA合成期(S期)、有絲分裂期(M期)的進(jìn)程以及G1/S

3、期、G2/M期的轉(zhuǎn)換至關(guān)重要.有證據(jù)表明 cyclinA2 具有癌基因活性,其反常增多與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān).同時cyclinA2也是多種癌基因促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程中的關(guān)鍵靶點,如致癌基因c-Fos可通過cyclinA2的失控表達(dá)使成骨細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展為骨肉瘤.目前在多種癌變組織包括骨肉瘤中發(fā)現(xiàn)cyclinA2蛋白的高表達(dá)或過表達(dá),而在正常組織細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá).臨床研究顯示cyclinA2高表達(dá)與骨肉瘤的不良預(yù)后密切相關(guān).這些證

4、據(jù)均提示抑制或消除cyclinA2在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)有可能成為骨肉瘤治療的一個有效策略. PuNA干擾(RNAi)是廣泛存在于真核生物中的特定基因轉(zhuǎn)錄后沉默機制,其作用機理是通過細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶Dicer將進(jìn)入細(xì)胞的長雙鏈RNA(dsRNA)剪切成20bp左右的短雙鏈RNA片斷,然后這些短雙鏈RNA的單鏈與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)結(jié)合,指導(dǎo)RISC結(jié)合并剪切靶mRNA以達(dá)到特定基因沉默的作用.這些長20bp左右的短

5、雙鏈RNA片斷被稱為小干擾RNA(siRNA),它是RNA干擾機制的核心.sirNA基因沉默技術(shù)克服了傳統(tǒng)反義核酸策略的諸多缺陷,是目前為止發(fā)現(xiàn)的最為強勁且最有前途的基因抑制方法.但siRNA的特異性及抑制效率也會被一些因素所影響,如何避免這些因素的干擾是應(yīng)用此項技術(shù)不可回避的問題. 本研究首先針對cyclinA2基因設(shè)計并合成三對不同序列的siRNA,靶向骨肉瘤細(xì)胞MG-63及正常人成纖維細(xì)胞HSF的cyclinA2基因進(jìn)行沉

6、默,通過在不同時間點檢測三對不同序列siRNA作用下兩種細(xì)胞cyclinA2的表達(dá),選擇出基因抑制效率最高的siRNA序列,同時確定最佳抑制濃度及時間.然后用篩選出的siRNA特異性的抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63及正常人成纖維細(xì)胞HSF內(nèi)cyclinA2的表達(dá),通過檢測兩種細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期、平板克隆形成能力及相關(guān)基因表達(dá)的變化,探討cyclinA2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的地位,以及能否作為新的基因靶點應(yīng)用于骨肉瘤的治療. 第一部分

7、:不同序列的cyclinA2-siRNA對骨肉瘤及成纖維細(xì)胞cyclinA2基因的沉默作用 目的:研究三對不同序列的siRNA對骨肉瘤細(xì)胞MG-63及正常人成纖維細(xì)胞HSF@cyclinA2基因mRNA及蛋白表達(dá)的抑制作用,挑選最佳抑制序列并確定最適抑制濃度及時間. 方法:設(shè)計并化學(xué)合成三對靶向cyclinA2基因的siRNA:siRNA<,1>、siRNA<,2>和siRNA<,3>,同時設(shè)計并合成一對與任何基因無同源

8、性的無義siRNA.用質(zhì)脂體Lipofectamine<'TM>2000將各組siRNA分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞及正常成纖維細(xì)胞HSF,以磷酸緩沖液PBS替代siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染作為空白對照,以無義siRNA轉(zhuǎn)染作為陰性對照.除劑量實驗中濃度梯度為1nM、10nM、50nM,100nM外,其余實驗均轉(zhuǎn)染50nM濃度的siRNAs.分別用熒光實時定量PCR、western-blot檢測cyclinA2 mRNA及蛋白表達(dá)的沉默效果.

9、 結(jié)論 1.3對cyclinA2-siRNA均能抑制骨肉瘤及成纖維細(xì)胞中 cyclinA2 基因的表達(dá),其中siRNA1抑制效率高于另外2對. 2.siRNA<,1>在轉(zhuǎn)染后48h基因抑制效率最高并在50nM濃度以下存在著劑量依賴性,高于50nM濃度其基因抑制效率并無明顯增加. 3.選取化學(xué)合成的siRNA并以低濃度進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染是防止siRNA脫靶效應(yīng)及非特異效應(yīng)產(chǎn)生的有效措施. 第二部分:沉默c

10、yclinA2基因?qū)侨饬黾俺衫w維細(xì)胞增殖的影響 目的:研究沉默cyclinA2基因的表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG-63及正常人成纖維細(xì)胞HSF的生長影響,探討cyclinA2在骨肉瘤細(xì)胞增殖中的作用及抑制其表達(dá)作為骨肉瘤治療方法的可行性. 方法:用Lipofectamine<'TM>2000將siRNA<,1>分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞及正常成纖維細(xì)胞HSF.MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染10nM及50nM兩種濃度的siRNA<,1>,

11、HSF細(xì)胞只轉(zhuǎn)染50nM濃度的siRNA<,1>.以PBS替代siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染作為空白對照,對照組轉(zhuǎn)染50nM無義siRNA.采用四唑鹽比色法(MTT)評價細(xì)胞的增殖活性.流式細(xì)胞(FCM)周期檢測評價細(xì)胞周期分布的改變.RT-PCR評價cyclinB1及PCNA基因表達(dá)的變化.轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)14～18天,平板克隆培養(yǎng)法觀察細(xì)胞克隆形成情況. 結(jié)論 1. 降低cyclinA2基因的表達(dá)能有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致其