組織工程化培養(yǎng)模型下力學(xué)載荷與植物雌激素聯(lián)合調(diào)控小鼠前成骨細(xì)胞及骨重建機制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種代謝性疾病,其特征是骨量下降和骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞,表現(xiàn)為骨的脆性增加,因而骨折的危險性大為增加。隨著我國乃至全球老年人口的增加,骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率處于上升趨勢,被世界衛(wèi)生組織列為中老年三大疾病之一。OP主要發(fā)病機制是機體的骨重建失衡。當(dāng)破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)行使的骨吸收作用大于成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)行使的骨形成作用時就會發(fā)生OP。骨

2、重建是一個多因素參與的復(fù)雜過程,力學(xué)載荷和雌激素都是影響其主要因素。實驗探討植物雌激素α-玉米赤酶醇(α-Zearalanol,α-ZAL)為代表的化學(xué)信號和以力學(xué)載荷為代表的物理信號耦合作用對骨重建的影響,通過建立二維和三維,組織工程化培養(yǎng)模型,考察OB對這兩種不同信號的生物學(xué)響應(yīng)機制。研究結(jié)果為戰(zhàn)傷骨折救治提供了理論基礎(chǔ),也為預(yù)防OP,由“被動醫(yī)療”轉(zhuǎn)向“主動健康”提供臨床參考。因此,研究工作對于相關(guān)骨疾病的治療與康復(fù)進(jìn)行了有意義的

3、探索。
　　研究方法：
　　1.傳代培養(yǎng)小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1,采用不同濃度α-ZAL作用于細(xì)胞72h后,MTT法檢測細(xì)胞增殖活性,PNPP法檢測ALP活性,RT-PCR檢測ALP、OPG及RANKLmRNA的表達(dá)水平;
　　2.采用四點彎曲力學(xué)加載裝置,選擇頻率為0.5Hz,強度1000με和2500με的力學(xué)拉伸應(yīng)變作為力學(xué)加載組,α-ZAL(10-6、10-8、10-10M)作為藥物作用組,對MC3T3

4、-E1細(xì)胞進(jìn)行單獨作用及聯(lián)合作用。力學(xué)加載方式為1次/d,1h/次。細(xì)胞處理72h后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖情況;PNPP法檢測ALP活性;realtimeRT-PCR檢測ALP、Runx2、OPG及RANKLmRNA的表達(dá)水平;Westernblot分析方法檢測RUNX2、OPG及RANKL蛋白表達(dá);
　　3.殼聚糖與透明質(zhì)酸進(jìn)行交聯(lián)改性,改性后與膠原按不同比例制備三種改性殼聚糖/膠原/羥基磷灰石復(fù)合支架;對改性后的殼聚糖進(jìn)

5、行紅外和差示掃描量熱圖譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析;考察復(fù)合支架的孔徑、孔隙率、密度、力學(xué)強度等理化性質(zhì);支架接種細(xì)胞后考察細(xì)胞生長曲線并進(jìn)行HE染色等形態(tài)學(xué)觀察;
　　4.應(yīng)用動態(tài)載荷與循環(huán)灌流反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞-支架復(fù)合物。CCK-8法檢測三種不同流速(5,10,20ml/min)和3500με力學(xué)壓載(1Hz,2h/d)的力學(xué)環(huán)境下成骨細(xì)胞的增殖能力;SEM考察細(xì)胞支架復(fù)合物表面和內(nèi)部細(xì)胞的分布及形態(tài);免疫組化染色和Westernblot分析

6、法考察細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。VonKossa礦化結(jié)節(jié)染色法考察細(xì)胞支架復(fù)合物動態(tài)培養(yǎng)礦化情況;
　　5.在三維動態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞支架復(fù)合物體系中加入不同濃度的α-ZAL(10-6、10-8、10-10M),CCK-8法檢測增殖,PNPP法檢測ALP活性,Westernblot分析OPG,RANKL蛋白表達(dá)。
　　實驗結(jié)果：
　　1.10-6-10-12Mα-ZAL可顯著抑制成骨細(xì)胞的增殖(P<0.05);10-6-10-

7、12Mα-ZAL均可使ALP活性增加(P<0.05),但不同劑量間存在作用時間差異。10-6-10-10Mα-ZAL均可上調(diào)成骨細(xì)胞內(nèi)OPG/RANKLmRNA的比值(P<0.05);
　　2.力學(xué)拉伸單獨作用于成骨細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞增殖,ALP活性以及RUNX2蛋白表達(dá),并可以提高OPG/RANKL比值。雖然力學(xué)載荷與α-ZAL耦合后仍然抑制成骨細(xì)胞增殖,但高濃度α-ZAL(10-6M)耦合高強度拉伸應(yīng)變(2500με)能夠顯著提高

8、ALP活性;α-ZAL耦合高強度拉伸應(yīng)變能夠顯著上調(diào)RUNX2蛋白表達(dá)。α-ZAL耦合低強度拉伸應(yīng)變(1000με)可顯著上調(diào)OPG/RANKL比值;
　　3.紅外和差示掃描量熱圖譜證明透明質(zhì)酸和殼聚糖以酰胺鍵形成交聯(lián)的新化合物;掃描電鏡顯示孔徑在50-250mm之間,孔隙率分別為46.2±1.88,50.4±5.14,62.5±4.53(％);密度分別為0.1049±0.24,0.0921±8.01,0.0509±5.34(g/

9、ml);彈性模量分別為:1.51±0.19,29.31±0.38,36.94±0.25(KPa);生長曲線結(jié)果:前7天B、C樣品中活細(xì)胞數(shù)量明顯高于A樣品,從第10d開始,三種樣品中細(xì)胞數(shù)量相差不大,均出現(xiàn)平臺期;HE染色發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞在培養(yǎng)初期沿著支架材料內(nèi)部空隙貼壁生長,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,貼壁細(xì)胞呈集落樣生長,可明顯看到細(xì)胞間連接;
　　4.利用生物反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞支架復(fù)合物,選擇灌流流速為10ml/min顯著促進(jìn)MC3T3

10、-E1細(xì)胞增殖;支架接種細(xì)胞并且動態(tài)培養(yǎng)5d后,細(xì)胞黏附于支架壁呈梭形和不規(guī)則形狀,伸出偽足,分泌少量的絨毛和ECM;COLI、OPN和OCN的免疫組化染色均為陽性;Westernblot分析結(jié)果動態(tài)培養(yǎng)7d時COLI的表達(dá)量顯著上調(diào);OPN的表達(dá)顯著下降;OCN在體外培養(yǎng)12d后表達(dá)量沒有發(fā)生改變;
　　5.高濃度α-ZAL抑制三維動態(tài)培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖,并促進(jìn)ALP活性的增加。通過上調(diào)OPG蛋白表達(dá),下調(diào)RANKL蛋白表達(dá)而增加

11、OPG/RANKL比值。
　　結(jié)論：
　　1.α-ZAL為新近發(fā)現(xiàn)一類植物雌激素,對成骨細(xì)胞活性的影響尚未見文獻(xiàn)報道。研究發(fā)現(xiàn)α-ZAL可抑制成骨細(xì)胞的增殖、促進(jìn)分化,并可通過上調(diào)OPG/RANKLmRNA表達(dá)比值抑制破骨細(xì)胞的活化,有望成為OP的治療藥物;
　　2.拉伸應(yīng)變可有效促進(jìn)成骨分化,且具有強度依賴性;當(dāng)與化學(xué)信號耦合,能進(jìn)一步上調(diào)成骨細(xì)胞分化能力;但低強度拉伸應(yīng)變耦合α-ZAL通過上調(diào)OPG/RANKL比值

12、更有利于抑制破骨細(xì)胞活化,調(diào)節(jié)骨重建;
　　3.透明質(zhì)酸改性殼聚糖/膠原/納米羥基磷灰石復(fù)合材料作為一種新型有機無機復(fù)合支架材料,有利于促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、增殖,同時也可為三維藥物篩選提供良好平臺;
　　4.生物反應(yīng)器的研發(fā)與應(yīng)用成為三維培養(yǎng)不可缺少的技術(shù)平臺。應(yīng)用自主研發(fā)的循環(huán)灌流和動態(tài)壓載反應(yīng)器可實現(xiàn)組織工程骨的體外培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)流速10ml/min聯(lián)合3500με壓應(yīng)變的參數(shù)條件較適合細(xì)胞支架復(fù)合物的動態(tài)培養(yǎng)。OB在HA