IDO基因轉(zhuǎn)染組織工程化軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受的研究.pdf

1、軟骨缺損的修復(fù)是臨床一大難題，由于自體軟骨移植來源有限，組織工程化軟骨移植將是解決損傷軟骨修復(fù)的重要途徑，然而，組織工程化軟骨具有免疫原性。本課題擬通過轉(zhuǎn)染吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）基因以達(dá)到改變軟骨細(xì)胞移植后局部T細(xì)胞免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)的目的，誘導(dǎo)移植受體的T細(xì)胞對(duì)同種異體組織工程化軟骨移植物的免疫耐受，為發(fā)展轉(zhuǎn)基因方法預(yù)防臨床同種異體移植后自身免疫排斥的技術(shù)奠定基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)組織工

2、程化的種子細(xì)胞能用于不同免疫遺傳背景的患者，克服MHC（major histocompatibility complex,主要組織相容性復(fù)合物）的多態(tài)性和多基因性所形成的同種異體間的免疫屏障，達(dá)到組織工程化種子細(xì)胞的“通用化”，開辟了從移植物局部解決免疫排斥的新途徑。主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　(一)小鼠軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
　　1．C57小鼠關(guān)節(jié)軟骨的獲取：體外經(jīng)0.2％Ⅱ型膠原酶37℃消化3～4h后離心，收集可以獲取供實(shí)驗(yàn)

3、用的大量軟骨細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色消化法獲取的軟骨細(xì)胞活力在95％以上。
　　2．原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞貼壁后于第2～5d進(jìn)入指數(shù)生長期，7d左右可以鋪滿瓶底，但是隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形成一代的時(shí)間明顯延長。
　　3．軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)甲苯胺藍(lán)染色呈明顯藍(lán)色異染反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)獲取的軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞純度在85％以上，但是隨著傳代次數(shù)增多軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的

4、能力下降，因此，選擇第2、3代軟骨細(xì)胞是用于實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)期。
　　(二)軟骨細(xì)胞pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)
　　1．在最優(yōu)化的脂質(zhì)體和質(zhì)粒比例下(2:1)，質(zhì)粒pEGFP-N1-IDO被脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞仍能貼壁生長。
　　2．熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞中EGFP表達(dá)的監(jiān)測(cè)表明，綠色熒光均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，于轉(zhuǎn)染后12h開始并在48h時(shí)有較強(qiáng)表達(dá)。E

5、GFP在胞漿和胞核中均有表達(dá)，但胞漿中表達(dá)明顯高于胞核表達(dá)。
　　3．于轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)收集軟骨細(xì)胞，多聚甲醛固定后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞中EGFP的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后隨著時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)染效率呈先上升，后下降的趨勢(shì)。于轉(zhuǎn)染后24h達(dá)到最高峰，48h后轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)36％。
　　4．軟骨細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR在RNA水平可檢測(cè)到mIDO表達(dá)，與β-actin的光密度值相比，軟骨細(xì)胞中基因的相對(duì)表達(dá)量穩(wěn)定。
　　(

6、三)mIDO轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞體外對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響
　　1．利用高壓液相色譜（HPLC）分析mIDO轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中色氨酸的含量，24h后單純軟骨細(xì)胞組色氨酸含量為4.93～5.71mg/L，平均為5.3±0.39mg/L，而基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞組未檢測(cè)到色氨酸。在細(xì)胞培養(yǎng)液中色氨酸的降解，同時(shí)也伴隨著犬尿氨酸代謝產(chǎn)物的增加，對(duì)細(xì)胞上清液中色氨酸消除動(dòng)力學(xué)研究表明，轉(zhuǎn)基因軟骨細(xì)胞上清液中色氨酸的降解明顯快于單純軟骨細(xì)胞組。

7、>　　2．轉(zhuǎn)基因軟骨細(xì)胞體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，以2×105個(gè)經(jīng)3000radγ射線照射的脾淋巴細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞和3×105個(gè)淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞作為免疫應(yīng)答細(xì)胞，于混合反應(yīng)后第5d、6d、7d、8d通過MTT法檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，較單純淋巴細(xì)胞脾細(xì)胞組，轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因組淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)了增殖（P＜0.02），且轉(zhuǎn)IDO基因組淋巴細(xì)胞增殖較未轉(zhuǎn)基因組明顯減慢（P＜0.05）。
　　3．混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中以CFSE標(biāo)記免

8、疫應(yīng)答細(xì)胞，共同培養(yǎng)96h后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)應(yīng)答T細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)基因組和未轉(zhuǎn)基因組應(yīng)答細(xì)胞均出現(xiàn)了增殖（P＜0.01），共形成9代細(xì)胞。IDO基因轉(zhuǎn)染組96h后總體增殖指數(shù)為1.122±0.017，單純淋巴細(xì)胞陰性對(duì)照組為1.026±0.016，陽性單純軟骨細(xì)胞組為1.201±0.026，較陽性對(duì)照組，IDO基因組同種異體T淋巴細(xì)胞增殖得到明顯抑制。
　　結(jié)論：消化法可獲取供實(shí)驗(yàn)用的大量原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，且第2、3代軟骨細(xì)胞是用

9、于實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)期；脂質(zhì)體有望成為原代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞良好的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，mIDO被導(dǎo)入原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞后，對(duì)EGFP監(jiān)測(cè)表明，IDO在細(xì)胞中得到了穩(wěn)定表達(dá)，且主要表達(dá)于胞漿；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞體外培養(yǎng)中明顯降解培養(yǎng)液中色氨酸濃度，為IDO通過降解局部微環(huán)境中色氨酸濃度而抑制同種異體T細(xì)胞增殖提供科學(xué)依據(jù)；體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，表達(dá)mIDO轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞明顯抑制同種異體T細(xì)胞增殖，為基因轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞通過降解局部微環(huán)境中色氨酸的濃度抑制T細(xì)胞的增殖