綠膿桿菌制劑對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　檢測綠膿桿菌制劑(PA-MSHA,Pseudomon asaeruginosa-manllose sensitive hemagglutinin)對人乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性包括抗增殖、誘導(dǎo)凋亡特性等的影響,并深入探討其作用靶點(diǎn)以及體內(nèi)體外實驗中對人乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分
　　1、光學(xué)顯微鏡觀察PA-MSHA作用后細(xì)胞形態(tài)變化。
　　2、WST(water-soluble

2、 tetrazolium salt)法測定PA-MSHA以及PA對入乳腺癌細(xì)胞或正常乳腺上皮細(xì)胞體外增殖的影響,并繪制細(xì)胞增殖曲線。
　　3、標(biāo)準(zhǔn)PI染色流式細(xì)胞計數(shù)法(flow cytometry,FCM)檢測PA-MSHA對人乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響。
　　4、Annexin V-FITC和PI染色流式細(xì)胞計數(shù)法檢測PA-MSHA對人乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　5、Hoeehst33258染色檢測PA-MSHA

3、作用后乳腺癌細(xì)胞核凋亡形態(tài)的變化。
　　6、透射電鏡觀察PA-MSHA作用后乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　7、Western blot法檢測PA-MSHA或PA作用后凋亡相關(guān)級聯(lián)蛋白水平的變化。
　　第二部分
　　1、采用甘露糖或葡萄糖作用PA-MSHA共培育試劑,與PA-MSHA或PA共同作用于乳腺癌細(xì)胞,作為競爭性作用試劑,來檢測其對PA-MSHA作用效應(yīng)的影響。主要采用WST法、Annexin V-FITC和

4、PI染色流式細(xì)胞計數(shù)法、Hoechst33258染色、掃描電鏡、western blot等方法檢測甘露糖共培育對PA-MSHA引起的抗增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯等的影響。
　　2、通過Western blot檢測PA-MSHA作用于乳腺癌細(xì)胞后EGFR通路下游主要分子總EGFR、磷酸化EGFR、總Akt、磷酸化Akt、總ERK和磷酸化ERK的表達(dá)水平。
　　3、設(shè)計并合成針對人EGFR基因的RNA干擾片段,將siRNA片段

5、瞬轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞中,Western blot法驗證片段下調(diào)EGFR表達(dá)的有效性。主要觀察EGFR下調(diào)后PA-MSHA對EGFR下游通路蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞增殖水平的影響,以驗證EGFR是否為PA-MSHA作用靶點(diǎn)。
　　4、通過Western blot以及ELISA方法檢測PA-MSHA作用于乳腺癌細(xì)胞后侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　5、裸鼠乳房脂肪墊(mammary fat pad,MFP)接種人乳腺癌細(xì)胞,探討PA-

6、MSHA對裸鼠原位腫瘤生長及肺轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-21HM以及MDA-MB-468細(xì)胞體外培養(yǎng),PA-MSHA對乳腺癌細(xì)胞有直接殺傷作用,且有劑量依賴性以及時間依賴性,而對MCF-7細(xì)胞以及正常乳腺上皮MCF-10A相對耐藥。而PA對乳腺癌細(xì)胞沒有明顯的殺傷作用。
　　2、PA-MSHA在體外能引起G0-G1期的細(xì)胞比例增高,而S期細(xì)胞比例顯著降低。
　

7、　3、PA-MSHA作用后能使乳腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)出大量的圓形漂浮凋亡細(xì)胞形態(tài),產(chǎn)生大量的吞噬體以及自噬體樣空泡,體現(xiàn)為凋亡表現(xiàn)形態(tài);細(xì)胞胞核呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征。
　　4、PA-MSHA作用于乳腺癌細(xì)胞后凋亡細(xì)胞的比率顯著升高。
　　5、PA-MSHA對乳腺癌細(xì)胞有殺傷作用以凋亡為主,并依賴于caspase通路,可以看到easpase3、8、9活性片段表達(dá)增強(qiáng),而PA沒有該作用。
　　第二部分
　　1、掃描電鏡

8、發(fā)現(xiàn)PA-MSHA能粘附于乳腺癌細(xì)胞表面,并表現(xiàn)為皺縮、凋亡的細(xì)胞形態(tài),在甘露糖作為競爭性抑制劑后,PA-MSHA無法粘附于細(xì)胞表面。
　　2、經(jīng)甘露糖共培育后,PA-MHA對MDA-MB-231HM以及MDA-MB-468細(xì)胞相對耐藥,其IC50值顯著高于第一部分結(jié)果中所示的敏感細(xì)胞的IC50值;甘露糖共培育后,PA-MSHA的細(xì)胞周期阻滯作用以及誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞作用均被抑制,caspase凋亡相關(guān)蛋白沒有明顯的活化。
　　3

9、、PA-MSHA在體外能顯著降低EGFR通路活性,AKT以及ERK的磷酸化水平均有明顯下降。
　　4、下調(diào)EGFR表達(dá)后,PA-MSHA對EGFR下游通路蛋白的下調(diào)作用受到抑制。
　　5、下調(diào)EGFR表達(dá)后,PA-MSHA對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用受到抑制,細(xì)胞死亡數(shù)目減少,存活率增高。
　　6、在甘露糖拮抗后,PA-MSHA對EGFR通路的抑制作用變得不明顯,即磷酸化的EGFR通路相關(guān)蛋白并沒有顯著下調(diào),表現(xiàn)其甘露糖對其作

10、用的抑制性。
　　7、PA-MSHA作用后細(xì)胞中的一些和促侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)水平下降,抑制侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平上調(diào)。
　　8、在體內(nèi),PA-MSHA能明顯抑制乳腺癌裸鼠移植瘤肺轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能與PA-MSHA在多環(huán)節(jié)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成以及下調(diào)乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、PA-MSHA在體外可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長,作用機(jī)制可能是通過抑制EGFR通路、死亡受體和線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤