肌-眼-腦病病理生理機制的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:肌-眼-腦病是一種常染色體隱性遺傳性疾病,為編碼N-乙酰氨基葡萄糖-氧位-甘露糖轉(zhuǎn)移酶 1(protein-O-linked manrloseβ1,2-N-acetylglucosaminyl -transferase1,POMGnT1)的基因缺陷,臨床表現(xiàn)為嚴重的肌營養(yǎng)不良、眼缺陷以及智力障礙。為了闡明該病的病理生理機制已經(jīng)進行了許多研究,發(fā)現(xiàn)患者或者動物模型的腦內(nèi)存在神經(jīng)元遷移異常。然而,迄今為止,神經(jīng)元遷移異常是如何發(fā)生的、

2、生物體內(nèi)還有哪些繼發(fā)變化等問題還沒有得到解決。 目的: 探討肌-眼-腦病的病理生理機制,了解該病神經(jīng)元遷移缺陷的發(fā)生過程以及基因表達譜的變化。 方法: 1.產(chǎn)生POMGnT-1 基因敲除小鼠并確定基因型,以同一窩的野生型小鼠作為正常對照。 2.應(yīng)用免疫熒光染色的方法顯示小腦基底膜層、膠質(zhì)細胞界膜和顆粒細胞的發(fā)育;免疫熒光雙標(biāo)染色的方法顯示Laminin和膠質(zhì)細胞酸性蛋白之間的關(guān)系;應(yīng)用高爾基染色顯

3、示小腦的細胞形態(tài)。 3.進行BrdU皮下注射,免疫標(biāo)記識別 S 期的分裂細胞,進行出生后日期計數(shù)。 4.應(yīng)用電鏡分析來檢查軟腦膜基底膜層的完整性和顆粒細胞的分化情況。 5.應(yīng)用 YFPH 小鼠顯示由黃色熒光蛋白標(biāo)記的苔蘚纖維。 6.分離小腦皮質(zhì),提取mRNA。 7.利用Affymetrix公司的基因芯片,獲取 POMGnT-1 基因敲除小鼠小腦皮質(zhì)的基因差異表達譜,通過該公司的信息分析中心,進一步

4、分析微陣列信息。 8.合成cDNA,行實時定量PCR證實微陣列數(shù)據(jù)。 結(jié)果: 1.POMGnT-1 基因敲除小鼠的軟腦膜基底膜層局灶的缺口和膠質(zhì)細胞界膜的破壞與外生發(fā)層的細胞異位明確相關(guān)。Bergman 膠質(zhì)細胞的纖維回縮、紊亂、或突出到異位區(qū)域,缺乏正常的 Bergman 膠質(zhì)細胞纖維的腳手架是導(dǎo)致神經(jīng)元遷移失敗的原因。不過,異位的 EGL 細胞可以發(fā)育成成熟的顆粒細胞,并與苔蘚纖維形成突觸。 2.和野

5、生型相比較,POMGnT-1缺陷小鼠的大多數(shù)的基因的表達水平增加。在這些基因中,S100 鈣結(jié)合蛋白、酪氨酸羥化酶、小腦鋅指樣蛋白、calbindin 2、鳥苷酸結(jié)合蛋白增加的 fold 數(shù)較高,分別為27.39、13.97、13.94、11.64、11.00;僅有少數(shù)的幾個基因的表達水平下降,分別為神經(jīng)絲3-M、POMGnT-1和一個編碼未知蛋白的基因。表達變化的基因分成轉(zhuǎn)錄、代謝、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、遷移、糖基化等組,其中,轉(zhuǎn)錄、代謝、

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