四川省豬嵴病毒病流行病學調查及間接ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、豬嵴病毒(Porcine kobuvirus)是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)嵴病毒屬(Kobuvirus)成員。2008年，匈牙利學者首次報道在無臨床癥狀表現(xiàn)的豬糞便中發(fā)現(xiàn)豬嵴病毒;2009年，在中國豬群中也檢出了豬嵴病毒。自此之后，多個國家報道在豬群中檢測到豬嵴病毒，包括泰國、日本、韓國、荷蘭、巴西、西班牙、意大利、東非等。豬嵴病毒是一種具有傳染性、在世界范圍內廣泛分布的新型病毒，在腹瀉豬中有較高檢出率，認為可能

2、是豬腹瀉的病原，但鑒于其在沒有腹瀉的豬群中也普遍存在，且目前尚未能實現(xiàn)體外分離培養(yǎng)，需要更多的研究來闡明其生物學特性及病原特性。
　　本研究旨在對四川地區(qū)豬嵴病毒病流行情況進行調查，并對四川株豬嵴病毒VP1基因分子流行病學特點進行分析;VP1蛋白是嵴病毒暴露在最外面的結構蛋白，是嵴病毒的優(yōu)勢免疫蛋白，本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng)，表達豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原表位區(qū)，利用純化的重組蛋白建立一種檢測豬血清中豬嵴病毒抗體的間接ELISA

3、方法，為今后豬嵴病毒血清學診斷方法的研究奠定基礎。
　　本研究在2011-2012年從四川豬場中收集了163份豬糞便和腸道組織樣品，其中112份來自腹瀉豬，51份來自沒有腹瀉的豬。利用RT-PCR方法對樣品進行檢測，豬嵴病毒的總陽性率為53.4％(87/163)，腹瀉樣品中豬嵴病毒總檢出率為64.3％(72/112)，采集自無腹瀉豬的樣品中，豬嵴病毒的感染率為29.4％(15/51)。利用SPSS21.0軟件對腹瀉組數(shù)據(jù)和無腹瀉組

4、數(shù)據(jù)進行卡方檢驗，結果顯示豬嵴病毒感染和腹瀉具有極顯著相關性，x2=17.126，p=3.5×10-5;在哺乳仔豬、保育豬、育肥豬和成年母豬中，豬嵴病毒的感染率依次為:66.7％、39.1％、23.5％、40.0％，對四個年齡段感染數(shù)據(jù)進行卡方檢驗，分析顯示哺乳仔豬和豬嵴病毒感染具有極顯著相關性，x2=10.941，p=9.4×10-4。腹瀉豬和幼齡豬可能對豬嵴病毒更易感。
　　利用RT-PCR擴增豬嵴病毒VP1基因序列，通過分子

5、克隆，測序得到35個豬嵴病毒VP1基因序列（GenBank登錄號:KF157917-KF157951），核苷酸序列相似性為80.7％-100％，氮基酸序列相似性為87.2％-100％。利用MEGA5.0軟件對豬嵴病毒VP1基因序列進行系統(tǒng)進化分析，結果顯示本研究獲得的四川株豬嵴病毒分屬于四個大的分支，說明多株豬嵴病毒在四川地區(qū)流行，進化樹顯示豬嵴病毒VP1基因序列的分群無明顯地域性差異。通過序列分析，表明在兩只豬的糞便樣品中分別檢出3株

6、和2株豬嵴病毒共同感染，首次為多株豬嵴病毒共感染提供了依據(jù);通過重組分析軟件RDP和Simplot預測，發(fā)現(xiàn)3株共感染的豬嵴病毒A1、A2、A3之間存在重組事件，A2序列的VP1區(qū)段可能是由于A1和A3之間發(fā)生重組產生的。重組事件的發(fā)生會推動病毒基因組的進化，導致基因多樣性的發(fā)生。
　　本研究通過BepiPred、Bcepred、DNAStar中Protean來預測分析豬嵴病毒VP1蛋白線性抗原表位，綜合各種預測結果，選擇抗原表位

7、較集中、抗原指數(shù)較高的前半段(1-462bp)作為豬嵴病毒優(yōu)勢抗原表位區(qū)，將選取的基因片段送公司進行密碼子優(yōu)化后合成基因，將合成的基因片段定向克隆至原核表達載體pET32a(+)中，構建重組表達質粒pET32-VP1，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中進行誘導表達，通過對誘導條件進行優(yōu)化，確定37℃，0.2mmol/L IPTG誘導表達4h為最佳誘導條件，重組蛋白大小為35.6KDa，以可溶性形式存在，在Western blo

8、t檢測中，通過Ni柱純化的VP1重組蛋白和豬嵴病毒陽性血清存在特異性反應，說明重組蛋白具有良好的抗原性。
　　利用純化的重組蛋白作為包被抗原，初步建立豬嵴病毒抗體檢測間接ELISA方法，并對間接ELISA反應的各個條件進行優(yōu)化，結果顯示，抗原的最佳包被濃度為2μg/mL，血清最適稀釋倍數(shù)為1∶200，37℃1h+4℃過夜為重組蛋白最適包被條件，5％脫脂奶粉封閉90min為最適封閉液和封閉時間，待檢血清溫育時間為60min，酶標二抗

9、工作濃度為1∶6000，作用時間為60min，TMB底物作用時間為15min，陰陽性臨界值為0.250。建立的間接ELISA檢測方法具有較好特異性，與豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒6種常見豬病病原陽性血清無交叉反應。建立的方法具有較好的重復性，批內重復性實驗和批間重復性實驗，變異系數(shù)均小于10％。用建立的間接ELISA方法，對170份豬血清樣本進行檢測，結果顯示65份血清為