人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨誘導(dǎo)活性材料構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 骨缺損，尤其大段骨缺損，其治療仍是骨科臨床所面臨的難題之一。傳統(tǒng)采用的植骨材料多缺乏生物活性，在體內(nèi)的降解速率快慢不一，促成骨作用往往有限。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，取材方便，具有自我更新和多向分化的能力，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)其具有很強(qiáng)的成骨能力，是骨組織工程研究理想的種子細(xì)胞。骨誘導(dǎo)活性材料具有三維立體結(jié)構(gòu)，生物相容性好，在體內(nèi)可降解，符合骨組織工程對生物支架材料的要求。目前，種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合所面臨的問題是

2、，種子細(xì)胞的接種效率低下，流失量大，以及細(xì)胞在支架內(nèi)的不均勻分布。本課題采用骨誘導(dǎo)活性材料為載體，對人自體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外三維培養(yǎng)，構(gòu)建個(gè)體化的組織工程骨。同時(shí)，采用自體富含血小板血漿(PRP)作為種子細(xì)胞的雙相接種媒介，增加細(xì)胞的黏附和成骨，以構(gòu)建適合臨床應(yīng)用的組織工程骨，為骨缺損的臨床個(gè)體化移植治療提供有用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有重大的應(yīng)用前景。
　　 方法：
　　 1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。<

3、br>　　 采集骨髓，比較全骨髓貼壁和密度梯度離心兩種方法細(xì)胞分離效率，比較細(xì)胞在胎牛血清和自體血清中的生長，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式檢測免疫表面標(biāo)志物的表達(dá)。MTT法測定第3、5代細(xì)胞的增殖，繪制生長曲線。
　　 2.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及成骨能力研究。
　　 取自體血清培養(yǎng)的第3代細(xì)胞，分別進(jìn)行體外成脂和成骨誘導(dǎo)。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，以油紅O染色檢驗(yàn)細(xì)胞的成脂性，以Ⅰ型膠原、骨鈣素和鈣化結(jié)節(jié)檢驗(yàn)細(xì)胞的成骨性

4、；比較成骨誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組細(xì)胞的ALP含量；RT-PCR檢測兩組的ALP和OPN mRNA表達(dá)。
　　 3.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨誘導(dǎo)活性材料-富含血小板血漿凝膠復(fù)合物構(gòu)建組織工程骨的體外實(shí)驗(yàn)研究。
　　 以BrdU標(biāo)記第3代細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)。取第3代細(xì)胞以傳統(tǒng)靜置接種法和PRP雙相接種法構(gòu)建細(xì)胞-生物支架復(fù)合物，比較兩組接種細(xì)胞的黏附率，測定兩組復(fù)合物的ALP含量差別；RT-PCR檢測兩組ALP和OPN m

5、RNA表達(dá)差別。以掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料內(nèi)的生長增殖和基質(zhì)分泌情況。
　　 4.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨誘導(dǎo)活性材料-富含血小板血漿凝膠復(fù)合物構(gòu)建組織工程骨的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 以新西蘭大白兔建造股骨骨缺損動物模型，將構(gòu)建的組織工程骨分為3組：Ⅰ組為單純骨誘導(dǎo)材料組；Ⅱ組為傳統(tǒng)靜置法構(gòu)建工程骨組；Ⅲ組為雙相接種構(gòu)建工程骨組。分別移植入動物模型體內(nèi)修復(fù)骨缺損，觀察術(shù)后動物一般情況；X線檢查，觀察骨缺損處成骨情況；組織切片HE

6、染色觀察支架材料降解、新生骨生長情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)全骨髓貼壁分離和密度梯度離心兩種方法都可成功分離細(xì)胞，自體血清培養(yǎng)和胎牛血清均可培養(yǎng)出成纖維樣細(xì)胞。MTT法生長曲線顯示第3、5代細(xì)胞均有較強(qiáng)的增殖能力。密度梯度離心自體血清培養(yǎng)的第5代細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測，其表達(dá)CD44、CD90，不表達(dá)CD34、CD45。
　　 2.第3代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21天后，Ⅰ型膠原、骨鈣素和鈣化結(jié)節(jié)染色陽性；成

7、脂誘導(dǎo)21天后油紅O染色陽性；在成骨誘導(dǎo)過程中，ALP含量逐漸增高，與未誘導(dǎo)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組均有ALP表達(dá)，未誘導(dǎo)組表達(dá)較弱，誘導(dǎo)組中有OPN表達(dá)，而未誘導(dǎo)組則無表達(dá)。
　　 3.以BrdU標(biāo)記第3代細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性；以傳統(tǒng)靜置接種法和PRP雙相接種法構(gòu)建細(xì)胞-生物支架復(fù)合物，分別比較細(xì)胞接種4h，8h，12h，24h后細(xì)胞粘附率，后者高于前者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

8、<0.05)；兩種方法接種細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后ALP含量逐漸增高，后者高于前者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示兩種方法接種誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組均有ALP和OPN表達(dá)，但未誘導(dǎo)組表達(dá)較弱；掃描電鏡觀察PRP雙相接種法構(gòu)建組織工程骨，細(xì)胞在材料表面生長，并可延入材料孔隙之中，有基質(zhì)分泌。
　　 4.各組組織工程骨植入兔股骨骨缺損處，傷口生長良好一期愈合，無不良反應(yīng)。X線顯示實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后12周基本達(dá)到骨愈合，對照組在術(shù)后12

9、周時(shí)愈合可，空白組骨愈合不滿意。HE染色觀察到空白組8周后骨誘導(dǎo)活性材料基本被吸收，對照組和實(shí)驗(yàn)組8周起可見支架的材料降解和新生骨組織，12周可見實(shí)驗(yàn)組成骨更好。
　　 結(jié)論：
　　 1.密度梯度離心法分離和自體血清培養(yǎng)獲得的成分均一、增殖能力強(qiáng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可作為種子細(xì)胞。
　　 2.富含血小板血漿雙相接種法可促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨誘導(dǎo)活性材料的黏附及成骨，有利于構(gòu)建組織工程骨。
　　 3.構(gòu)