骨髓間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程化氣管模型的實驗研究.pdf

1、目的：本實驗擬通過體外細胞培養(yǎng)的方法，將豬間充質(zhì)干細胞白骨髓血中分離出來，進一步在體外的培養(yǎng)，并誘導其向軟骨樣細胞、上皮樣細胞、血管內(nèi)皮樣細胞分化，探討其作為組織工程化氣管種子細胞的可能性。 方法：收集豬骨髓血，采用密度梯度離心和貼壁生長的方式，提取單個核細胞進行體外培養(yǎng)；觀察其生長方式；收集第2～3代(P2～P3)細胞用含10ug/L TGF-β1的DMEM-HG培養(yǎng)液誘導、分化為軟骨樣細胞；用含COL-I(濃度25mg/L)

2、、乙酸(濃度0.1％)的培養(yǎng)液向呼吸道上皮細胞誘導、分化；用含10ng/mL VEGF的培養(yǎng)液誘導、分化為血管內(nèi)皮樣細胞；對所誘導、分化的細胞進行形態(tài)學觀察和RT-PCR檢測、免疫組化以及相關(guān)抗原的免疫熒光鑒定。 結(jié)果：通過密度梯度離心和貼壁生長的方法，可以獲取具有一定形態(tài)特點、貼壁生長、增殖活躍的豬骨髓間充質(zhì)干細胞；豬BMMSCs在含10ug/L TGF-β1的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，細胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，甲苯胺藍染色可見紫紅色異染出現(xiàn)

3、；RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA呈陽性表達；免疫組化檢查Ⅱ型膠原為陽性；BMMSCs經(jīng)誘導培養(yǎng)后免疫組化顯示細胞角蛋白陰性；BMMSCs在含VEGF(10ng/mL)的培養(yǎng)液中誘導，細胞形態(tài)也逐漸發(fā)生變化，2w后，外觀呈現(xiàn)為鵝卵石樣形態(tài)，胞漿豐富，免疫表型顯示細胞陽性表達vWF。 結(jié)論：1、用密度梯度離心和貼壁的方法可以得到數(shù)量較多的豬BMMSCs，可以提供組織工程化氣管所需的種子細胞：2、豬BMMSCs可以在體外誘導分化為軟