人脫細(xì)胞羊膜負(fù)載大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程膀胱的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及誘導(dǎo)、分化成平滑肌樣細(xì)胞的實驗研究
　　 目的：采用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁法從大鼠骨髓中分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增、傳代，應(yīng)用1％二甲基亞砜（DMSO）和大鼠膀胱組織勻漿上清液誘導(dǎo)分化成平滑肌樣細(xì)胞，探討為組織工程膀胱的構(gòu)建提供種子細(xì)胞的可能性。
　　 方法：無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨和胸骨，用吸取D-Hank's液的注射器沖出骨髓細(xì)胞，置于含10％FBS、

2、100u/ml雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進(jìn)行純化。待細(xì)胞達(dá)95％融合時，用0.125％的胰酶-0.02％的EDTA消化2-3min后進(jìn)行傳代。倒置相差顯微鏡觀察原代及傳代后的細(xì)胞生長特點。HE染色光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征。掃描電鏡（SEM）觀察細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)特征。利用MTT法測定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線，了解細(xì)胞生長特性。取第4代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用1％二甲亞砜

3、（DMSO）預(yù)誘導(dǎo)8小時，然后應(yīng)用大鼠膀胱組織勻漿上清液誘導(dǎo)7天。倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)分化后的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并運用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測特異性蛋白標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)。選用未進(jìn)行誘導(dǎo)的MSCs作為陰性對照組。
　　 結(jié)果：原代培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞成分復(fù)雜，1-2天開始有少量細(xì)胞貼壁，形狀不規(guī)則，有長梭形、多角形等。半量換液后，克隆生長的細(xì)胞團(tuán)塊開始迅速增殖，以集落生長為主。7-9天左右細(xì)胞可長滿培養(yǎng)瓶底，達(dá)

4、95％以上融合，主要呈長梭形，其中散在少量折光性強(qiáng)的小圓形細(xì)胞。細(xì)胞整體排列更趨于規(guī)律性，呈漩渦狀，輻射狀或魚群樣排列。傳代后的細(xì)胞貼壁及生長更加迅速，2h后部分細(xì)胞即開始貼壁，24h內(nèi)即可完全貼壁，6～7天可鋪滿培養(yǎng)瓶底。細(xì)胞形態(tài)更均一，長梭形，整體呈漩渦狀，輻射狀或魚群樣排列。HE染色示胞體以紡錘形居多，有突起，細(xì)胞核大、深染，核仁明顯。掃描電鏡觀察主要為三種形態(tài)的細(xì)胞：寬大扁平形的細(xì)胞為主，長梭形和圓球形細(xì)胞占少數(shù)。表面可見大量微

5、絨毛樣突起，類似樹突。P2、P4、P6細(xì)胞生長曲線基本相同，分為潛伏期（第1-2天）、對數(shù)生長期（第3-5天）和平臺期（第6-7天），且?guī)状?xì)胞間生長狀況穩(wěn)定。第4代大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過1％二甲基亞砜（DMSO）和大鼠膀胱組織勻漿上清液誘導(dǎo)可分化成為梭形平滑肌樣細(xì)胞，融合后形成峰谷狀排列，部分細(xì)胞表達(dá)平滑肌特異性蛋白標(biāo)志物α-肌動蛋白。其誘導(dǎo)分化率為（45.6±3.5）％，陰性對照組的分化率為（3.8±0.77）％，二者相比差異有統(tǒng)計

6、學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離法可以快速的分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并使其在體外迅速得到了增殖，而且性狀穩(wěn)定。
　　 2.P2、P4、P6大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線基本相同，細(xì)胞增殖快，且?guī)状?xì)胞間生長狀況穩(wěn)定。
　　 3.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)膀胱組織勻漿上清液誘導(dǎo)可分化為平滑肌樣細(xì)胞，可作為膀胱修復(fù)的種子細(xì)胞進(jìn)一步研究，從而為后續(xù)實驗研究打下基礎(chǔ)。

7、　　 第二部分生物支架材料-人脫細(xì)胞羊膜的制備
　　 目的：探討人脫細(xì)胞羊膜的制備方法及其作為生物支架材料應(yīng)用于組織工程膀胱構(gòu)建的可行性。
　　 方法：取新鮮人羊膜，鈍性分離羊膜與絨毛膜組織，去除羊膜基底面殘存的絨毛膜和血管組織，采用去污劑洗滌法和酶消化進(jìn)行脫細(xì)胞處理。處理后的材料進(jìn)行HE染色及電鏡檢查有無細(xì)胞成分殘留。以誘導(dǎo)分化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為鑒定細(xì)胞接種子96孔板中，分別采用人脫細(xì)胞羊膜浸提液及完全培養(yǎng)基進(jìn)

8、行培養(yǎng)，應(yīng)用MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性測定。將6-8片處理好的單層脫細(xì)胞羊膜按彼此纖維方向垂直的位置重疊，以200W的可見光照射3h，使其交聯(lián)增厚，增加張力。
　　 結(jié)果：制備好的單層人脫細(xì)胞羊膜為白色半透明的薄膜，有一定彈性及韌性，厚約0.1mm。光鏡觀察無細(xì)胞成分殘留，掃描電鏡觀察為有膠原蛋白形成的多微孔結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞殘留。細(xì)胞毒性測定為Ⅰ級，細(xì)胞相容性好。交聯(lián)后的人脫細(xì)胞羊膜厚度0.6-0.8mm，張力大大增加，能耐受縫合和牽拉。

9、
　　 結(jié)論：采用去污劑洗滌和酶消化可以對新鮮人羊膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理獲得脫細(xì)胞羊膜。所獲支架材料具有一定的彈性、韌性及多微孔結(jié)構(gòu)，為種子細(xì)胞的貼附和代謝提供了較好的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時該支架材料細(xì)胞毒性低、具有良好的組織相容性。交聯(lián)后的脫細(xì)胞羊膜厚度及張力大大增加，能耐受縫合和牽拉，是理想的組織工程用生物支架材料。
　　 第三部分組織工程膀胱的體外構(gòu)建及大鼠膀胱替代實驗
　　 目的：通過采用誘導(dǎo)分化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

10、（MSCs）和人脫細(xì)胞羊膜（HAAM）構(gòu)建組織工程膀胱的實驗研究，探討應(yīng)用組織工程膀胱進(jìn)行大鼠膀胱替代修復(fù)的可行性。
　　 方法：以誘導(dǎo)分化成功的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）作為種子細(xì)胞，以制備好的人脫細(xì)胞羊膜（HAAM）作為生物支架材料，將MSCs靜態(tài)接種于HAAM表面，進(jìn)行體外培養(yǎng)5天，獲得組織工程膀胱。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼附情況。HE染色及掃描電鏡（SEM）觀察組織工程膀胱情況。將雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為A、B、

11、C3組，A、B兩組分別12只，C組6只，均行半膀胱切除術(shù)，然后分別采用負(fù)載MSCs的HAAM（A組）、單純HAAM（B組）以及直接縫合（C組）的方法進(jìn)行膀胱修補(bǔ)。于術(shù)后2、4、8周分別測定膀胱最大容積及解剖取材觀察膀胱組織再生情況，8周時行膀胱造影檢查。
　　 結(jié)果：HAAM與MSCs復(fù)合培養(yǎng)第1～2天細(xì)胞增殖不明顯，第3天時開始有細(xì)胞直接貼附于HAAM。隨時間延長，貼附的細(xì)胞逐漸增多。復(fù)合培養(yǎng)第5天，HE染色可見MSCs貼附于

12、羊膜，胞體較大，呈長梭形，細(xì)胞形態(tài)一致。掃描電鏡觀察可見細(xì)胞散在貼附在材料表面，伸有偽足，并生長入支架材料的孔隙中。大鼠膀胱重建術(shù)后2周時A組膀胱的Volmax為1.21±0.60ml，B組為1.12±0.53ml，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，C組為0.75±0.41ml，與A、B兩組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義。隨時間延長，4周、8周時大鼠的膀胱最大容積略有增加，但A、B兩組仍無差別。術(shù)后8周時膀胱造影檢查可見A、B兩組膀胱形態(tài)大致正常，而C組膀胱

13、形態(tài)明顯縮小。大體標(biāo)本檢查：A、B組術(shù)后2周膀胱修補(bǔ)吻合區(qū)愈合良好，無漏尿：4周時膀胱修補(bǔ)吻合區(qū)與正常組織無界限。8周時已經(jīng)近似正常膀胱，基本為正常組織所替代。膀胱腔內(nèi)均無結(jié)石形成。修復(fù)區(qū)病理組織學(xué)觀察：2周時A、B兩組支架材料即已降解吸收，修補(bǔ)區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤，內(nèi)側(cè)可見膀胱移行上皮細(xì)胞生長。A組可見平滑肌細(xì)胞形成，B組無明顯平滑肌細(xì)胞。4周時浸潤的炎性細(xì)胞明顯減少，大量毛細(xì)血管長入。A組平滑肌細(xì)胞增多，B組稀疏可見平滑肌細(xì)胞。8周時