聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進組織工程骨形成的實驗研究.pdf

1、顱頜面部骨缺損是平、戰(zhàn)時意外事故的常見損傷，臨床需做骨缺損修復(fù)的病例很多。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)對骨原細(xì)胞的分化起決定性作用，是促進成骨的重要因子之一；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是在創(chuàng)傷愈合過程中促進血管再生發(fā)揮著重要作用的生長因子，是最強的促血管生成因子。VEGF和BMP參與顱面部骨缺損修復(fù)過程中的不

2、同階段，二者具有協(xié)同作用。 本研究在創(chuàng)建兔顱骨缺損動物模型的基礎(chǔ)上，對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)進行體外的分離和培養(yǎng)，在傳代后采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方式，將外源性VEGF165及BMP2通過前期已成功構(gòu)建的hVEGF165與hBMP2真核細(xì)胞共表達(dá)載體pIRES-hBMP2-hVEGF165導(dǎo)入到BMSCs中，使其正常表達(dá)，以提高BMSCs的成骨能力

3、，再將轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置入聚乳酸可吸收材料內(nèi)，隨材料一起植入骨缺損部位，觀察組織工程骨形成，骨缺損修復(fù)成骨情況。本實驗通過大體形態(tài)學(xué)觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查和免疫組化等方法檢測聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染后BMSCs促進顱骨缺損修復(fù)重建的效果。 結(jié)果： 1.大體形態(tài)學(xué)改變：4周時轉(zhuǎn)染組顱骨缺損區(qū)開始被新生骨組織代替，表面有皮質(zhì)骨生成；對照組顱骨缺損區(qū)無明顯骨痂形成，表面被肉芽組織包裹。8周時轉(zhuǎn)染組骨缺損區(qū)有大量骨痂生成，質(zhì)地變

4、硬；對照組僅在骨缺損區(qū)邊緣可見部分骨痂形成。12周時轉(zhuǎn)染組骨缺損區(qū)基本被新生骨覆蓋，質(zhì)地較硬。對照組骨缺損區(qū)邊緣有較多骨痂生成，中心區(qū)域無明顯骨質(zhì)覆蓋。 2.x線檢查：術(shù)后2周時轉(zhuǎn)染組開始出現(xiàn)模糊骨痂，中心區(qū)域有散在點狀密度增強。對照組缺損邊界明顯，未見明顯骨痂生成。術(shù)后4周時轉(zhuǎn)染組缺損區(qū)出現(xiàn)明顯骨痂，中心區(qū)域出現(xiàn)片狀密度增強。二組缺損邊緣出現(xiàn)骨痂，中心區(qū)域未見骨痂。8周時轉(zhuǎn)染組缺損區(qū)基本被新生骨痂包裹。對照組邊緣區(qū)域骨痂增多。

5、12周轉(zhuǎn)染組缺損區(qū)基本消失，密度較周圍正常略低。對照組缺損面積變小，但中心無新骨形成。 3．組織學(xué)變化：轉(zhuǎn)染組術(shù)后2周時有大量纖維性骨痂生成，骨缺損附近骨外膜內(nèi)層的間充質(zhì)細(xì)胞分裂增殖，向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，肉芽組織中軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)目很多，軟骨島形成。4周時纖維性骨痂、軟骨骨痂與骨性骨痂混雜在一起，以纖維性骨痂和軟骨骨痂為主，有較多的新生血管，并出現(xiàn)軟骨內(nèi)骨化，可見部分軟骨骨化，形成橋接骨痂。8周時成骨細(xì)胞、纖維母細(xì)胞減

6、少、纖維骨痂消失，代之以軟骨骨痂和骨性骨痂。12周時骨組織結(jié)構(gòu)趨于完善，骨髓腔基本形成。對照組僅在骨缺損附近有成骨反應(yīng)和少量新骨生成。 4．VEGF165表達(dá)情況轉(zhuǎn)染組VEBF在術(shù)后2周時，軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞呈陽性表達(dá)，基質(zhì)內(nèi)陽性表達(dá)，4周時軟骨細(xì)胞分裂增生，呈團狀排列，表達(dá)達(dá)到高峰，呈強陽性。對照組2周時在新生的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞內(nèi)呈陽性表達(dá)，4周時僅部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)。 5．BMP2蛋白表達(dá)情況轉(zhuǎn)染組BMP2在術(shù)后2

7、周時，在原始骨痂、成骨細(xì)胞、骨端骨細(xì)胞、新形成的軟骨基質(zhì)內(nèi)呈陽性。4周時，新形成的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)陽性染色，軟骨基質(zhì)也呈陽性。幼稚軟骨細(xì)胞、骨痂表面成骨細(xì)胞呈陽性。對照組2周時新生的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞呈陽性表達(dá)，4周時僅部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)。 結(jié)論： 1.通過pIRES-hBMP2-hVEGF165重組質(zhì)粒體外經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進組織工程骨形成的研究，我們初步實現(xiàn)從體外研究向體內(nèi)研究的深入，并進一步闡明在新骨生成