甲型流感病毒血凝素廣譜單抗作用機(jī)制研究及血凝素單抗在流感免疫治療中的作用.pdf

1、甲型流感病毒(Influenza A virus)持續(xù)變異并在人群中廣泛傳播，是造成人類致病性及死亡性的最重要病原體之一。因病毒的高度變異性，現(xiàn)有的疫苗及抗病毒策略的效率受到嚴(yán)重限制，本文就甲型流感病毒最重要的表面抗原血凝素蛋白(HA)在廣譜單抗的誘導(dǎo)及應(yīng)用方面的兩個(gè)重要問(wèn)題進(jìn)行探討，共由兩部分組成。
　　 其中第一部分旨在尋找流感病毒血凝素頭部區(qū)的廣譜單抗、鑒定廣譜表位，并研究廣譜單抗產(chǎn)生及作用的分子機(jī)制。HA蛋白是甲型流感病

2、毒最主要的表面抗原，也是宿主免疫應(yīng)答的主要攻擊靶點(diǎn)，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體及細(xì)胞免疫應(yīng)答，是現(xiàn)行流感疫苗的關(guān)鍵性成分。為逃避宿主的免疫壓力，HA表現(xiàn)出高度變異的特點(diǎn)，使得流感疫苗及治療性藥物需要不斷更新。盡管如此，隨著近年來(lái)對(duì)HA研究的深入，已發(fā)現(xiàn)在HA表面存在相對(duì)保守的表位可以誘導(dǎo)產(chǎn)生不同程度的廣譜單抗。因此，進(jìn)一步尋找流感病毒HA的廣譜中和單抗以及所識(shí)別的保守表位，對(duì)流感的廣譜治療及廣譜疫苗的開(kāi)發(fā)具有重要意義。
　　 本研

3、究以H1N1亞型人流感病毒為研究對(duì)象，通過(guò)定期搜集分離人季節(jié)性及新型H1N1病毒，對(duì)病毒HA進(jìn)行基因進(jìn)化分析及病毒抗原性分析，挑選出代表性病毒進(jìn)行廣譜免疫策略摸索及常規(guī)單抗篩選，建立了一個(gè)含300多株H1亞型特異性單抗在內(nèi)的總量達(dá)900多株各亞型HA特異性單抗的血凝素單抗庫(kù)，根據(jù)單抗與代表性病毒的反應(yīng)性，從單抗庫(kù)中挑選了27株代表性單抗組成H1單抗盤，其中包括通過(guò)低劑量序貫免疫策略獲得的7株跨HA交叉廣譜單抗。
　　 研究結(jié)果表

4、明，以單抗12H5及G10D10為代表的7株廣譜單抗具有H1及H5廣譜交叉中和活性，其中單抗12H5能同時(shí)與季節(jié)性H1及新甲流H1反應(yīng)，而單抗G10D10對(duì)1933年至今的大部分季節(jié)性H1病毒具有廣譜反應(yīng)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)單抗12H5及G10D10具有跨HA廣譜治療活性。兩株單抗的識(shí)別表位均被定位于受體結(jié)合位點(diǎn)(RBD)附近，該區(qū)域是一個(gè)潛在的保守性廣譜表位區(qū)。
　　 采用單抗盤中對(duì)季節(jié)性H1病毒具有反應(yīng)性的6類單抗（包括7株跨H

5、A交叉廣譜單抗），進(jìn)行基于單抗基因的單抗聚類分析，根據(jù)單抗基因可將上述單抗劃分為6個(gè)聚類(Cluster)，同時(shí)分析每一聚類單抗的識(shí)別表位及反應(yīng)譜。結(jié)果表明，單抗盤基因譜系分析所反映出的規(guī)律和單抗表位分析的規(guī)律高度一致，每個(gè)聚類單抗識(shí)別相同的表位，且7株廣譜單抗在單抗聚類上屬于同一分支，單抗基因均來(lái)源于VGAM3.8 VH9重鏈基因家族及IGKV21輕鏈基因家族。同時(shí)，7株單抗均識(shí)別上述位于RBD附近的保守表位區(qū)。通過(guò)單抗同源建模及結(jié)構(gòu)

6、水平的分析證實(shí)，廣譜單抗的特定基因來(lái)源決定了單抗的CDR區(qū)在結(jié)構(gòu)上與其他非廣譜單抗相區(qū)別，且區(qū)別主要集中于單抗輕鏈CDR1區(qū)及重鏈CDR3區(qū);單抗與HA三聚體的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)一步表明，廣譜單抗與HA的結(jié)合主要依賴于上述的LCDR1區(qū)及HCDR3區(qū)，并巧妙地通過(guò)LCDR1區(qū)及HCDR3區(qū)插入到HA保守表位區(qū)與流感病毒HA相結(jié)合。
　　 上述研究結(jié)果表明，流感病毒頭部區(qū)存在廣譜表位，通過(guò)特定的免疫方式，可以誘導(dǎo)針對(duì)該表位區(qū)的廣譜單抗

7、，廣譜單抗在廣譜表位定位及廣譜抗病毒治療方面均具有應(yīng)用潛能;此外本部分研究還發(fā)現(xiàn)，單抗的廣譜性與單抗輕重鏈的基因選擇密切相關(guān)，廣譜單抗的特定基因家族組合決定了單抗能夠識(shí)別HA上的保守表位，從而決定了單抗的廣譜反應(yīng)性。
　　 本文的第二部分對(duì)流感血凝素單抗在抗病毒治療方面的應(yīng)用展開(kāi)研究，旨在探索甲型流感病毒血凝素特異性單抗的治療潛能及潛在的治療機(jī)制。單克隆抗體作為治療性藥物已在治療惡性腫瘤、移植排斥反應(yīng)、免疫相關(guān)疾病等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用

8、，并成為生物醫(yī)藥中最活躍的研究領(lǐng)域之一。對(duì)于流感等傳染性疾病，由于普遍存在的因病毒持續(xù)變異而導(dǎo)致的藥物耐藥性及疫苗效率低下的問(wèn)題，單克隆抗體也成為一個(gè)潛在的流感病毒預(yù)防及治療新工具。
　　 在第一部分研究中已初步證實(shí)，廣譜單抗具有潛在的治療潛能，在本部分研究中，對(duì)單抗的治療特征及潛在的治療機(jī)制進(jìn)行更深入的探索。首先，本部分研究利用新甲流H1病毒的小鼠感染及致死模型，分析不同類型單抗的治療潛能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中和性單抗及部分非中和性單

9、抗均具有高效治療潛能。單抗的治療具有劑量依賴性，其中中和性抗體6B9在1.25mg/kg的低劑量下就可以發(fā)揮100％的治療效果，并且，單抗6B9治療能夠在24h內(nèi)快速降低小鼠肺部的病毒量，并于48h內(nèi)清除體內(nèi)大部分病毒，體現(xiàn)了單抗治療的高效性。同時(shí)，本研究首次提出了單抗經(jīng)鼻給藥治療流感病毒的感染，并證實(shí)其治療效果優(yōu)于常規(guī)的尾靜脈注射給藥治療，提示對(duì)于呼吸道疾病，經(jīng)鼻給藥的治療途徑是一個(gè)潛在的替代途徑。
　　 選取中和單抗6B9、

10、14H2及非中和單抗9F1開(kāi)展單抗治療的機(jī)制研究，首先通過(guò)細(xì)胞水平試驗(yàn)證實(shí)，單抗6B9、14H2及9F1均不具備ADCC及CDC活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中和單抗6B9、14H2的治療作用主要依賴于單抗的中和作用，單抗F(ab’)2也能發(fā)揮治療作用，而不依賴于單抗的Fc片段介導(dǎo)的ADCC及CDC作用;不同的是，非中和單抗9F1的治療作用依賴于單抗的Fc片段，單抗F(ab’)2在單次給藥及連續(xù)給藥下均未能發(fā)揮治療作用，隨后通過(guò)單抗在Rag2-/-

11、，Il2rg-/-免疫缺陷小鼠體內(nèi)的治療實(shí)驗(yàn)證實(shí)，T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞缺失不影響單抗9F1的治療作用，進(jìn)一步說(shuō)明非中和單抗9F1的治療機(jī)制不依賴ADCC及CDC作用，可能通過(guò)Fc介導(dǎo)的其他免疫效應(yīng)途徑起到治療作用。
　　 上述研究表明，血凝素單抗具有高效的動(dòng)物保護(hù)效果，在低劑量下即可迅速清除被感染動(dòng)物體內(nèi)的病毒，同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻給藥的治療途徑在治療效果上優(yōu)于傳統(tǒng)的靜脈給藥。此外，本研究還建立了細(xì)胞水平及動(dòng)物水平的單抗治療