豬流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其間接ELISA方法的初步建立.pdf

1、豬流感是由豬流感病毒(Swineinfluenzavirus，SIV)引起的不同日齡、性別和品種豬只的一種急性、熱性和高度接觸性的呼吸道傳染病，其臨床上以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭和死亡為特征。1918年美國首次報(bào)道了SI的暴發(fā)，1930年Shope從豬體中首次分離到了H1N1亞型豬流感病毒。豬是禽、人、豬流感病毒重組和復(fù)制的“混合器”，豬流感病毒不需重組就有最大限度感染人的能力。而且，早期的人流感病毒還可以儲存于豬體內(nèi)，并在一定

2、時期內(nèi)再次感染人。目前，常見的豬流感主要有H1N1、H1N2和H3N2等3種亞型。 根據(jù)GenBank發(fā)表的豬流感血凝素(HA)基因和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出豬流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/05(H1N1)和A/Swine/Henan/S4/04(H3N2)的HA和NA基因片段，將其克隆到pFastBacGP67桿狀病毒載體上，篩選陽性重組轉(zhuǎn)座載體pFastBacGP67B-H1、pFast

3、BacGP67C-H3和pFastBacGP67A-N1、pFastBacGP67C-N2，轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體(bacmid)的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體獲得重組轉(zhuǎn)座子rBacmid-H1、rBacmid-H3和rBacmid-N1、rBacmid-N2，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBv-H1、rBv-H3和rBv-N1、rBv-N2，再感染細(xì)胞，收獲目的蛋白。通過血凝試驗(yàn)(HA蛋白)、

4、SDS-PAGE、免疫印跡法、免疫組化分析表明該蛋白得到表達(dá)，且具有良好的生物學(xué)活性。 利用表達(dá)的HA蛋白作為豬流感間接ELISA的抗原，初步建立H1和H3亞型豬流感的間接ELISA檢測方法，并對內(nèi)蒙古、遼寧和黑龍江等地豬場送檢的93份豬血清進(jìn)行了檢測。H1間接ELISA的結(jié)果有29份血清樣品呈陽性，陽性率為31.18％。H1試驗(yàn)有24份血清樣品呈陽性，陽性率為25.81％，和ELISA所檢測結(jié)果有29份陽性血清樣品相比，符合率

5、為94.62％；H3間接ELISA的結(jié)果有43份血清樣品呈陽性，陽性率為46.24％。H1試驗(yàn)有36份血清樣晶呈陽性，陽性率為38.71％，和ELISA所檢測結(jié)果有43份陽性血清樣品相比，符合率為92.47％；H1和H3間接ELISA的結(jié)果有17份血清樣品呈陽性，陽性率為18.28％。H1試驗(yàn)有15份血清樣品呈陽性，陽性率為16.13％，和ELISA所檢測結(jié)果有43份陽性血清樣品相比，符合率為97.85％；可見間接ELISA方法比H1試