流感病毒血凝素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的截短體-突變體的活性在靶向促凋亡分子中的應(yīng)用.pdf

1、本課題的研究目標(biāo)是對流感病毒血凝素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(HA2)進(jìn)行截短和突變,篩選獲得長度最短、轉(zhuǎn)位功能較強(qiáng)的HA2優(yōu)化短肽,用于靶向促凋亡分子的構(gòu)建。在本課題組前期的工作中,已將HA2引入到靶向促凋亡分子中,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有轉(zhuǎn)位活性,能夠促進(jìn)殺傷效應(yīng)分子從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)位到胞漿,增強(qiáng)抗腫瘤作用。在此基礎(chǔ)上,本研究對HA2進(jìn)行改構(gòu)優(yōu)化,設(shè)計(jì)獲得了6種截短體和3種突變體,通過體外紅細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)、腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(FRET)比較

2、這些HA2截短體/突變體的轉(zhuǎn)位功能強(qiáng)弱。
　　首先,我們利用體外紅細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)對HA2改構(gòu)體進(jìn)行功能篩選,如果破壞紅細(xì)胞膜的能力越強(qiáng),就會(huì)導(dǎo)致上清中血紅蛋白含量越高,表明HA2改構(gòu)體的轉(zhuǎn)位功能越強(qiáng)。以野生型HA2作為對照,將合成的上述9種HA2截短體/突變體與分離的人外周血紅細(xì)胞相孵育。劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)和時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明,在相同條件下E5C3的溶血能力強(qiáng)于HA2,E5弱于HA2,并且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴關(guān)系和某種程度的劑量依賴關(guān)系。

3、羧基端的3個(gè)截短體C3、C15、C8中,僅C3具有溶血能力,提示HA2的2個(gè)螺旋區(qū)對于溶血功能至關(guān)重要,去掉一個(gè)或兩個(gè)均會(huì)使HA2喪失溶血功能。氨基端的2個(gè)截短體N15和N3均喪失了溶血活性,說明氨基端第一個(gè)氨基酸的重要性,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而中間截短體M7、E5C3M7在增大劑量或延長時(shí)間時(shí),其溶血百分率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HA2,表明中間氨基酸殘基可能對HA2的溶血功能有貢獻(xiàn)。通過體外紅細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn),我們選出5個(gè)HA2截短體/突變體進(jìn)行下一步細(xì)

4、胞內(nèi)的功能篩選,其中HA2作為陽性對照,E5C3的轉(zhuǎn)位功能明確、強(qiáng)于HA2,C15、M7、E5C3M7的轉(zhuǎn)位功能微弱,遠(yuǎn)低于HA2。
　　其次,利用腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)對HA2改構(gòu)體進(jìn)行功能篩選。將HA2截短體/突變體引入本組前期構(gòu)建的其中一種靶向促凋亡分子中,如果這些重組分子對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用越強(qiáng),就表明HA2改構(gòu)體的轉(zhuǎn)位功能越強(qiáng)。本研究構(gòu)建了5種e23sFv-Fdt-HA2截短體/突變體-tBid,分別轉(zhuǎn)染兩種HER2陽性乳腺癌

5、細(xì)胞BT474和SKBR3,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明,E5C3的轉(zhuǎn)位效率強(qiáng)于野生型HA2;E5C3M7、C15、M7的轉(zhuǎn)位效率弱于HA2。
　　最后,利用FRET實(shí)驗(yàn)對HA2改構(gòu)體進(jìn)行功能篩選。將HA2截短體/突變體插入EGFP(FRET供體)和mCherry(FRET受體)之間,構(gòu)建HBsAg靶向的融合指示分子,如果FRET信號(hào)丟失越多、mCherry彌散分布的程度越高,就表明HA2改構(gòu)體的轉(zhuǎn)位功能越強(qiáng)。構(gòu)建了5種sc

6、Fv15-EGFP-Fdt-HA2截短體/突變體-mCherry,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞并建系,預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示COS7細(xì)胞分泌表達(dá)的scFv15-EGFP-Fdt-HA2-mCherry可內(nèi)化進(jìn)入乙肝表面抗原(HBsAg)陽性肝癌細(xì)胞PLC/PRF5中,并且呈內(nèi)吞體顆粒狀分布,為進(jìn)一步優(yōu)化FRET檢測窗口、分析mCherry亞細(xì)胞分布比率提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,HA2的突變截短體E5C3具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)位功能,為下一步