抗H3N2亞型豬流感病毒血凝素單抗的制備及抗原捕捉ELISA方法的建立.pdf

1、豬流感(swine influenza, SI)是由豬流感病毒(swine influenza virus, SIV)引起的一種急性傳染性呼吸道疾病，臨床表現(xiàn)發(fā)病率高、死亡率低，導(dǎo)致豬群嚴(yán)重發(fā)病往往是由于繼發(fā)感染了其它的一些細(xì)菌或者病毒而引起的；與此同時(shí)，豬不僅可感染人流感病毒，還可感染禽流感病毒，作為流感病毒種間傳播的中間宿主，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
　　 本研究采用純化的H3N2亞型SIV A/Swine/Guangdo

2、ng/9/05（H3N2）（以下簡稱SW/GD/9/05）免疫6 周齡BALB/c 雌性小鼠，加強(qiáng)免疫后取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 融合。采用血凝抑制（HI）和ELISA 方法篩選陽性細(xì)胞克隆，連續(xù)多次克隆培養(yǎng)后，獲得7 株親和力較高抗H3 亞型血凝素（HA）的單克隆抗體（McAb），分別命名為1C9、2C5、2F10、3D3、4E8、5C7、5D12，用其制備的腹水ELISA 效價(jià)分別為1: 105、1: 106、1: 104

3、、1: 105、1: 106、1: 105、1: 106；特異性試驗(yàn)表明7 株單抗均不與其他亞型SIV 和其他豬病病毒發(fā)生交叉性反應(yīng)。1C9、2C5、2F10、3D3單抗亞類為IgG1，而4E8、5C7、5D12 則是IgG2a，所有的單抗輕鏈均為κ型。
　　 Western-blot 結(jié)果顯示，這7株單抗都能識(shí)別HA蛋白，均能分泌針對(duì)血凝素的抗體。
　　 將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pCAGGS-H3HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞后

4、，分別用7 株單抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，能觀察到特異性綠色熒光，證實(shí)該7 株單抗具有良好的特異性。
　　 從已有的7株H3亞型單克隆抗體中取出一株（4E8）用辛酸－硫酸胺聯(lián)合沉淀法進(jìn)行純化，通過對(duì)ELISA 反應(yīng)各個(gè)工作條件的優(yōu)化，建立了以多抗作為包被抗體，單抗作為二抗的抗原捕捉ELISA方法。相關(guān)試劑最佳工作濃度分別為：血清1:8000倍稀釋，單抗0.5μg/孔，酶標(biāo)抗體1:5000稀釋；最佳反應(yīng)條件分別為：單抗37℃作用1.

5、0h，酶標(biāo)抗體37℃作用1.0h，底物室溫作用10min；最佳封閉液選擇為5％脫脂乳－PBS稀釋液。交叉性試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法與H1、H5、H9 亞型SIV 及其它豬病病毒均無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性；批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10％，重復(fù)性好；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法對(duì)純化的H3 亞型SIV 最低檢出量為3.11ng。
　　 最后，應(yīng)用建立的抗原捕捉ELISA方法對(duì)72份H3亞型SIV實(shí)驗(yàn)室感染SPF雞的拭子和肺臟樣品