再生家蠶絲素蛋白激發(fā)的T細胞應答.pdf

1、絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白,具有良好的理化特性及生物相容性。再生絲素蛋白是由絲素蛋白經物理方式、環(huán)氧劑或SD交聯而成的新型醫(yī)用生物材料。近年來,研究者通過物理或化學方法將絲素蛋白制備了符合臨床實際需要的再生多孔絲素膜,用于創(chuàng)面的修復。該材料具有良好的機械強度,不溶于水,膜的多孔結構使其富有較好通氣性的同時,可阻擋病原微生物侵入創(chuàng)面。該材料經機體吸收后可在體內逐漸被降解代謝。本研究在已對家蠶絲素蛋白對B細胞應答影響的研究基

2、礎上,又深入探討了不同性狀的再生家蠶絲素蛋白在小動物體內及體表應用后對T細胞應答的影響,從而為絲素蛋白類材料臨床應用后的免疫原性研究提供實驗依據。
　　 目的:通過研究不同性狀再生家蠶絲素蛋白材料對T細胞活化、增殖及分化的影響,分析絲素蛋白類材料的免疫原性。
　　 方法:
　　 1.液狀再生家蠶絲素蛋白體內運用對小鼠T細胞的激發(fā)作用
　　 將ICR小鼠隨機分組,每組6只,實驗組經腹腔注射1％的液狀再生家蠶

3、絲素蛋白0.5ml／只,以注射等量的無菌PBS為對照組。分別于第7d及第14d無菌取脾臟。制備細胞懸液作以下分析:
　　 1.1小鼠脾臟細胞中CD3+CD25+、CD4+CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T細胞的分析
　　 將上述分離的脾臟細胞雹于流式分析管中(3×10+細胞／管)。分別加入下列抗鼠直標抗體:第一組:CD3-FITC、CD25-APC；第二組:CD4-FITC、CD25-APC；第三組:CD4-F

4、ITC、CD25-APC及Foxp3-PE,反應后經FCM分析。
　　 1.2經再生家蠶絲素蛋白處理的小鼠脾臟細胞對ConA的反應性
　　 將上述分離的小鼠脾臟細胞加入96孔培養(yǎng)板,2×105／100μL／孔,加入ConA,終濃度分別為0μg／ml、2.5μg／ml及5μg／ml。培養(yǎng)至72h,MTT檢測細胞的增殖情況。同時采用FCM分析CD4+CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T的表達。
　　 2、膜狀

5、再生家蠶絲素蛋白在大鼠創(chuàng)面運用后對T細胞的激活作用
　　 2.1外科創(chuàng)傷面的建立
　　 將SD大鼠麻醉后經外科手術切除背部皮膚建立創(chuàng)面,面積為2 cm×2 cm。
　　 覆蓋經預處理的膜狀再生多孔絲素,將已切除皮膚的表皮蓋在絲素膜上,進行縫合。以PVA海綿設為陽性對照,假手術組為陰性對照。
　　 2.2移植處皮膚的病理學變化
　　 分別于術后第3d、14d、28d、56d及90d,在麻醉狀態(tài)下取移

6、植處皮膚,制作石蠟切片后行HE染色,分析炎性細胞的浸潤及創(chuàng)面愈合情況。
　　 2.3外周血,脾臟及胸腺中T細胞活化的動態(tài)變化
　　 于上述各時間點,取抗凝血分離PBMC,將大鼠處死,分離脾臟及胸腺細胞經FCM檢測CD3+CD25+T的比率。同時行免疫組化分析。
　　 結果:
　　 1.1液狀再生家蠶絲素蛋白體內運用后對小鼠T細胞活化與分化的影響
　　 FCM分析的結果顯示,腹腔注射液狀再生絲素蛋白

7、后第7d及第14d,脾臟細胞中CD3+CD25+T細胞的百分率分別為(7.32±1.02)％及(7.58±0.98)％；與對照組((7.262±1.31)％及(6.98±1.22)％)比較稍有升高,但無顯著性差異(P>0.05)。CD4+CD25+T細胞的百分率分別為(7.22±0.92)％及(7.38±0.49)％；與對照組((7.19±0.55)％及(7.03±0.69)％)比較稍有升高,但無顯著性差異(P>0.05)。CD4+CD

8、25+Foxp3+T百分率分別為(3.52±0.62)％及(3.78±0.56)％。與對照組((3.47±0.31)％及(3.44±0.65)％)比較稍有升高,但無顯著性差異(P>0.05)。提示再生絲素蛋白可能對小鼠T細胞無明顯的激發(fā)作用。
　　 1.2.經再生家蠶絲素蛋白處理的小鼠脾臟細胞對ConA的反應性
　　 2、膜狀再生家蠶多孔絲素蛋白對大鼠T細胞的激活作用
　　 2.1移植處皮膚的病理學變化
　

9、　 膜狀再生家蠶絲素蛋白移植后第3d及第14d時,移植處可見少量炎性細胞,28d后炎癥細胞已明顯減少,第56d時已無炎癥細胞。而陽性對照組大鼠術后均有炎癥細胞浸潤,至56d后才逐漸減少。
　　 2.2外周血、脾臟及胸腺細胞中T細胞活化的動態(tài)變化
　　 于術后第3d、14d、28d、56d及90d各時間點,膜狀再生家蠶絲素蛋白移植組大鼠PBMC、脾臟及胸腺中CD3+CD25+T細胞百分比率經FCM分析結果如表4所示:三者