家蠶絲素重鏈基因應(yīng)用的相關(guān)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文以重組AcMNPV為基因轉(zhuǎn)移載體，構(gòu)建了家蠶絲素重鏈基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的含不同長(zhǎng)度絲素重鏈N端序列、C端序列的EGFP融合蛋白的表達(dá)框，系統(tǒng)地研究了這些片段對(duì)融合蛋白分泌的影響。結(jié)果表明，絲素重鏈N端的兩個(gè)螺旋和C端64個(gè)氨基酸對(duì)重組融合蛋白的分泌沒有影響，這些序列的部分或全部缺失，融合蛋白能夠正常在家蠶后部絲腺合成與分泌；將帶絲素重鏈N端163個(gè)氨基酸的融合蛋白通過c端引入的His-tag純化標(biāo)簽進(jìn)行純化，測(cè)定成熟蛋白的N端序列，證明

2、絲素重鏈的信號(hào)肽切點(diǎn)發(fā)生在第21和22氨基酸之問。通過對(duì)信號(hào)肽序列的系統(tǒng)缺失分析表明，能夠使重組蛋白正常分泌的信號(hào)肽最短長(zhǎng)度是12個(gè)氨基酸，但此時(shí)重組蛋白的分泌效率已經(jīng)有所降低，并且信號(hào)肽的切點(diǎn)向后轉(zhuǎn)移至EGFP內(nèi)；絲素重鏈信號(hào)肽縮短到11個(gè)氨基酸，重組蛋白不能分泌：信號(hào)肽疏水區(qū)的最短長(zhǎng)度是8個(gè)氨基酸；絲素重鏈信號(hào)肽長(zhǎng)度為16個(gè)氨基酸時(shí)，融合蛋白能夠正常分泌，信號(hào)肽的切點(diǎn)正好發(fā)生在接口序列和EGFP之間，成熟蛋白的第一個(gè)氨基酸是EGFP

3、的第一個(gè)Met，這一結(jié)構(gòu)適用于外源基因表達(dá)時(shí)，更好地控制成熟蛋白的N端序列。 以AcMNPV為基因轉(zhuǎn)移載體，利用絲素重鏈基因啟動(dòng)子，將人工合成拼接的絲蛋白基因在家蠶后部絲腺獲得了表達(dá)。表達(dá)的人工合成絲蛋白能夠在家蠶后部絲腺正常分泌，并且能特異地與先前制備的蜘蛛絲蛋白多克隆抗體反應(yīng)，這為利用生物工程技術(shù)改造蠶絲性能提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 我們?cè)诮z素重鏈基因的3’側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了一段插入序列BmTH3，該插入序列的發(fā)生在家蠶不同