家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶是一類重要的水解酶，得名于Ser對底物的親核攻擊。絲氨酸蛋白酶作為蛋白酶家族的重要成員，其作用是斷裂大分子蛋白質中的肽鍵，從而使大分子蛋白質轉變成為小分子物質。絲氨酸蛋白酶的催化作用是通過其活性中心的催化三聯(lián)體變化實現(xiàn)的，它們之中一定有一個是絲氨酸，故得名絲氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶在哺乳動物體內有著非常重要的功能，消化酶、凝血因子以及補體系統(tǒng)中的很多成員都屬于絲氨酸蛋白酶。由于絲氨酸蛋白酶在胚胎發(fā)育、細胞分化、組織重建、血管

2、形成和防止病原侵入等方面起著非常重要的作用，因此關于動物絲氨酸蛋白酶的研究報道比較多。但是，有關昆蟲絲氨酸蛋白酶的研究報道仍然還是比較少。Ross等人(2003)利用果蠅基因組數(shù)據，對果蠅中的絲氨酸蛋白酶基因家族進行了鑒定，共獲得了119個基因。對該基因家族進行進化分析，發(fā)現(xiàn)基因重復和變異在該家族的形成過程中具有非常重要的作用。
　　家蠶基因組中同樣有眾多的基因編碼絲氨酸蛋白酶。在家蠶不同的組織中，含有多種絲氨酸蛋白酶。趙萍等人依

3、據家蠶基因組數(shù)據庫中的數(shù)據，參照其他物種中絲氨酸蛋白酶基因的序列，全面分析并鑒定了家蠶中的絲氨酸蛋白酶基因。在家蠶基因組中總共鑒定到143個絲氨酸蛋白酶基因，比果蠅中的119個基因多了24個。并對這些基因進行了系統(tǒng)的命名，分別記為:BmSP1～BmSP143。它們的分子量和等電點的分布比較廣泛。
　　氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，家蠶中絲氨酸蛋白酶按活性位點的完整性可分為兩類:一類是3個活性位點完整的SP類，有51個絲氨酸蛋白酶基因，另

4、一類則是活性位點不夠完整的SPH類。家蠶絲氨酸蛋白酶的功能廣泛，已有功能研究報道的家蠶絲氨酸蛋白酶包括:繭酶、卵黃蛋白降解蛋白酶、中腸堿性蛋白酶和卵巢蛋白酶等，它們的功能涉及到卵的形成、胚胎發(fā)育、消化，甚至絲蛋白的形成等領域，表明絲氨酸蛋白酶在維持家蠶的正常生長發(fā)育等生理活動中是不可缺少的。
　　家蠶中的絲氨酸蛋白酶除了含有催化結構域，還可能會含有其他的結構域。例如，有的絲氨酸蛋白酶含有CUB結構域。CUB結構域是含有大約110個

5、氨基酸的胞外結構域，因最初在三類蛋白中被鑒定到而得名，它們分別是Complement subcomponents Clr/Cls，Uegf和Bonemorphogenic protein-1。含有CUB結構域的蛋白有多種功能，它們都與生長發(fā)育相關。CUB結構域通常與其他結構域偶聯(lián)出現(xiàn)，其中包括絲氨酸蛋白酶結構域。很多包含CUB結構域的蛋白含有復合CUB結構域和復合蛋白酶結構域。它們在細胞分化，生長因子激活，降解多肽，細胞外生長發(fā)育進程中

6、發(fā)揮著重要的生理功能。
　　家蠶是一種經濟昆蟲，能夠分泌大量的絲纖維，在紡織工業(yè)中具有重要的經濟價值。絲腺作為家蠶唯一的泌絲器官，具有很高的研究價值，對家蠶絲腺吐絲機制的研究能夠有望提高蠶絲的產量和質量，產生巨大的經濟效益和社會效益。本實驗室在先前的研究中，通過對家蠶基因組芯片數(shù)據進行分析，發(fā)現(xiàn)家蠶絲氨酸蛋白酶基因BmSP82是家蠶絲腺中表達量最高的一種絲氨酸蛋白酶，并且在家蠶的前部和中部絲腺特異高量表達。絲氨酸蛋白酶基因BmSP

7、82的功能研究有助于闡明絲氨酸蛋白酶在絲腺中具有的獨特功能，促進我們對家蠶絲腺分泌絲蛋白的作用機制的理解，從而提高蠶絲的質和量，為生產作出貢獻。
　　綜上所述，我們選取了BmSP82作為研究對象。首先，對BmSP82進行了序列比對和信息分析，利用RT-PCR分析了其組織和時期表達特征。通過原核表達獲得了BmSP82成熟體的重組蛋白，通過注射小鼠進一步制備了BmSP82的多克隆抗體，然后利用多克隆抗體檢測了BmSP82在家蠶體內的存

8、在形式，利用BmSP82的CUB結構域抗體進行了組織定位;最后利用原核表達系統(tǒng)和酵母真核表達系統(tǒng)探究了BmSP82的酶活性。主要結果如下:
　　1、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的生物信息及表達特征分析;
　　BmSP82基因在SilkDB上的編號是BGIBMGA004445，基因定位于家蠶大造的第20號染色體上，具體位置為:nscaf2795:1108881..1115723(+strand)。芯片數(shù)據和RT-PCR結果表明

9、，BmSP82基因主要在家蠶的馬氏管和絲腺的前部和中部有表達。
　　結構域預測結果表明BmSP82基因編碼的絲氨酸蛋白酶是一個含有CUB結構域和胰蛋白酶結構域的絲氨酸蛋白酶。信息分析發(fā)現(xiàn)，它的前17個氨基酸為其信號肽序列，信號肽之后的N端含有一個由114個氨基酸殘基組成的CUB結構域，CUB結構域中含有8個半胱氨酸。C端含有一個胰蛋白酶類結構域，結構域中含有完整的三個保守氨基酸殘基:組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和絲氨酸(S

10、er)，它們是絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體。胰蛋白酶結構域中也含有8個半胱氨酸。兩個結構域之間由18個氨基酸殘基連接，連接部分含有2個半胱氨酸，酶原激活位點為異亮氨酸((I))。
　　2、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的原核表達和抗體制備;
　　通過對BmSP82的序列分析，設計了表達引物，以家蠶5齡3天絲腺cDNA為模板進行PCR，并將目的片段亞克隆到p28（pET28a改造）載體上，測序成功后轉化到表達菌株Transetta(

11、DE3)內，表達檢測發(fā)現(xiàn)BmSP82以包涵體形式表達。于是進行切膠純化，將重組蛋白注入昆明鼠體內，經過30多天的飼養(yǎng)，得到了效價為1∶10000的多克隆抗體。
　　3、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的蛋白水平的時空表達分析;
　　利用制備的多克隆抗體，檢測到BmSP82在家蠶的絲腺和馬氏管中有表達。進一步的檢測發(fā)現(xiàn)BmSP82在家蠶的前部絲腺和中部絲腺中有表達，在后部絲腺中沒有表達。對絲氨酸蛋白酶BmSP82在家蠶中部絲腺前區(qū)

12、進行了組織定位，發(fā)現(xiàn)其主要分布在家蠶中部絲腺前區(qū)的絲腺細胞層以及絲腺內膜和絲腺腔的幾丁質層之間，表明其可能參與了中部絲腺前區(qū)腔內細胞外基質的形成，從而保護絲腺細胞免受吐絲過程中絲蛋白對絲腺腔內側細胞的壓力和剪切力損傷。
　　4、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的表達及活性初探。
　　通過原核表達獲得了帶GST標簽的BmSP82成熟體，利用GST標簽進行了親和層析，得到了純度較高的GST-BmSP82重組蛋白。利用TEV酶切除Bm