重組家蠶絲素非結(jié)晶區(qū)肽段的制備與表征.pdf

1、家蠶絲素有出眾的機(jī)械性能和生物相容性，近年來越來越多的應(yīng)用于組織工程支架材料，家蠶絲素是一種結(jié)構(gòu)蛋白，蛋白空間結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能取決于它的氨基酸組成和序列。因此為了更好地控制基于蠶絲的生物材料的力學(xué)性能、空間結(jié)構(gòu)、聚集態(tài)結(jié)構(gòu)、降解速率等以適應(yīng)不同組織支架要求，研制出更理想的材料，及解析其用作生物材料的生物功能機(jī)理，需要系統(tǒng)的研究與分析絲素蛋白組成-空間結(jié)構(gòu)-功能之間的關(guān)系?；蚬こ碳夹g(shù)是系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能的一種重要手段。家蠶絲素由重鏈

2、、輕鏈和P25蛋白組成，重鏈?zhǔn)侵饕M成部分，在絲素中扮演了一個(gè)非常重要的角色。重鏈主要由結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)組成，采用基因工程技術(shù)研究結(jié)晶區(qū)及類結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)組裝已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。本文主要研究家蠶絲素重鏈非結(jié)晶區(qū)，通過基因工程的方法設(shè)計(jì)家蠶絲素重鏈非結(jié)晶區(qū)的基因序列，采用微生物表達(dá)系統(tǒng)大量制備蛋白、分離純化,并初步對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，為研究非結(jié)晶區(qū)序列的生物功能及對(duì)重鏈分子的結(jié)構(gòu)性能影響提供材料制備方法。
　　分析并根據(jù)家蠶絲素重鏈非結(jié)

3、晶區(qū)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了類家蠶絲素非結(jié)晶區(qū)肽段基序的編碼基因f(1)。通過基因工程技術(shù)首尾相連的方法，對(duì)設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行延伸加倍，構(gòu)建了含不同倍數(shù)非結(jié)晶區(qū)編碼基因的質(zhì)粒，分別為F(1)，F(xiàn)(2)，F(xiàn)(3)，F(xiàn)(4), F(8)和 F(12)。將各種序列長度基因分別克隆進(jìn)pGEX-KG和PET-30(a)兩種系列的表達(dá)載體，前者表達(dá)產(chǎn)物為His-融合蛋白，后者為GST-融合蛋白。采用DNA核酸電泳初步鑒定了克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體構(gòu)建的正確性，并進(jìn)一

4、步通過DNA測序表明家蠶絲素非結(jié)晶肽段基因成功地克隆并加倍至12倍，以及成功地構(gòu)建了表達(dá)載體，沒有發(fā)生任何基因突變和缺失。
　　將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌中誘導(dǎo)獲得表達(dá)。經(jīng)過 SDS-PAGE電泳和Western印跡技術(shù)分析表明表達(dá)載體pGEX-KG能更好地表達(dá)目的蛋白，得到了可溶性的融合蛋白。本文重點(diǎn)表達(dá)了非結(jié)晶區(qū)基序4倍和8倍的多肽，標(biāo)記為GST-F(4)B, GST-F(8)B。對(duì)兩種融合蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，調(diào)查了不

5、同誘導(dǎo)劑濃度(0，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L)和不同誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間(2，4，6，8 h)對(duì)GST-F(4)B, GST--F(8)B表達(dá)的影響，結(jié)果表明兩種融合蛋白GST-F(4)B和GST-F(8)B均在IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6h時(shí)表達(dá)量最高。為收集目的蛋白及定量分析表達(dá)效果，總蛋白采用GST親和層析柱進(jìn)行純化并用紫外吸收法測定蛋白濃度，定量分析獲得的兩種融合蛋白表達(dá)量每升菌液最大能達(dá)23mg和

6、14mg左右。
　　對(duì)GST-F(4)B, GST-F(8)B進(jìn)行了氨基酸組成分析，采用Thrombin酶進(jìn)行酶切從GST融合蛋白中釋放出目的蛋白F(4)B和F(8)B。Zeta-電位儀等電點(diǎn)分析結(jié)果為融合蛋白GST-F(4)B和GST-F(8)B的PI在4和5之間,目的蛋白F(4)B和F(8)B的PI在2和3之間，實(shí)測值與軟件預(yù)測結(jié)果基本符合。采用CD圓二色光譜對(duì)F(4)B和F(8)B二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探索，新鮮制備的溶液中F(