肝細胞癌及其癌前病變組織中相關抑癌基因的遺傳學研究.pdf

1、背景：
　　肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常見的惡性腫瘤之一；發(fā)病率居第五位，在癌癥死亡原因中居第三位。近來流行病學調查研究顯示其發(fā)病具有顯著的地域差異，全世界80％的病例分布在亞洲、非洲等發(fā)展中國家和地區(qū)；而在北歐、西歐和北美等地區(qū)其發(fā)病率較低，但最近幾年HCC在這些地區(qū)的發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升趨勢。HCC的發(fā)生發(fā)展不僅和環(huán)境因素有關，如乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感

2、染、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)感染、黃曲霉毒素(aflatoxins,AFT)、酒精和煙草等；另外，遺傳因素也起到重要作用。近年來對HCC發(fā)生發(fā)展機制的研究表明，原癌基因的激活和抑癌基因的失活是該腫瘤發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。許多研究發(fā)現(xiàn)在HCC組織中染色體1p、4q、6q、8p、13q、16q和17p的特定區(qū)域存在高頻率雜合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)，在發(fā)生染色體LOH的位點附近可能存

3、在與HCC發(fā)生相關的腫瘤抑制基因。還有研究發(fā)現(xiàn)在HCC發(fā)生的早期，異型增生結節(jié)(dysplasticnodules,DNs)和肝細胞腺瘤(hepatocellularadenoma,HA)等病變中也發(fā)生了與HCC類似的遺傳學變異，并且因此被認為是HCC的癌前病變；這些病變組織中染色體8p、17p、5p、13q、14q和16q等區(qū)域也存在基因片段的缺失，這就表明在HCC中出現(xiàn)的遺傳學改變有可能會出現(xiàn)在肝癌癌前病變中。因此，我們不僅要對HC

4、C，同時也要對其癌前病變進展過程中所涉及的遺傳學改變進行深入的探討，為HCC的診治提供更為精確的理論依據(jù)。
　　目的：
　　本實驗通過對染色體4q和8p上具有高度多態(tài)性的9個微衛(wèi)星位點在HCC和變異肝細胞結節(jié)(nodulesofalteredhepatocytes,NAH)標本中LOH率的檢測，并在蛋白質水平進一步檢測目的基因編碼蛋白質的表達，分析研究與HCC及NAH發(fā)生發(fā)展相關的抑癌基因。為HCC的預防、早期診斷和治療提供

5、精確的分子標志物。
　　方法：
　　1、收集HCC標本和NAH標本；采用顯微切割方法選出NAH細胞，和HCC標本一起用等體積酚氯仿抽提基因組DNA；
　　2、對所選出的9個微衛(wèi)星位點D4S2954、D4S3331、D4S3030、D4S415、D8S1725、D8S1754、D8S1810、D8S1827、D8S552，依據(jù)在GeneBank數(shù)據(jù)庫設計的引物分別進行聚合酶鏈式反應(polymerasechainreac

6、tion,PCR)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，然后分析個各位點LOH的發(fā)生率，選出在HCC和NAH中LOH發(fā)生率較高的位點，并查找其所對應的基因；
　　3、應用S-P免疫組織化學法檢測目的基因編碼蛋白質在HCC組織、NAH組織及其各自正常對照組織中的表達情況，進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　　1、在45例信息性HCC病例中，9個微衛(wèi)星位點總的染色體LOH率為66.7％；其中D8S552位點的LOH率最高位41

7、.9％；通過χ2檢驗或者Fisher確切概率法進行統(tǒng)計學分析(P<0.05)，得出該位點在性別(P=0.023)，血清甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)(P=0.004)和有無肝內轉移(P=0.023)均有統(tǒng)計學差異；D4S415是22.5％，D4S3331是22.3％，D8S1810是18.8％，D4S2954和D4S3030是15.4％，D8S1725是12.5％，D8S1827是9.8％,D8S1754是6.3％；

8、r>　　2、在38例變NAH標本中微衛(wèi)星位點D8S552的LOH發(fā)生頻率為7.89％；
　　3、45例HCC中12例肝經(jīng)常性丟失基因(deletedinlivercancer1gene，DLC-1)編碼的蛋白表達陽性，陽性率為26.7％；相對應的自身癌旁組織36例DLC-1蛋白表達陽性，陽性率為80％；對兩種組織中蛋白的表達率進行卡方檢驗(χ2=25.71,P<0.05)，DLC-1在HCC和癌旁組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義；DL

9、C-1蛋白在HCC中的表達在不同的年齡、性別中無差異，腫瘤的大小、是否有肝內轉移、是否伴有肝硬化及血清乙型肝炎表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)水平均無差別；
　　4、在38例NAH標本中檢測DLC-1蛋白表達，陽性的有26例，陽性率為68.42％。正常對照組織中有30例陽性表達，陽性率為78.9％。對兩種組織中蛋白的表達率進行卡方檢驗(P=0.442,P>0.05)，該蛋白在NAH和正常肝組

10、織中的表達差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1、染色體4q和8p上的三個位點D4S415、D4S3331和D8S552的雜合性缺失是HCC發(fā)生中的重要事件，提示幾個位點的附近可能存在著與HCC相關的潛在抑癌基因；并且為HCC相關的其他抑癌基因研究提供理論依據(jù)；
　　2、微衛(wèi)星位點D8S552在NAH組織中發(fā)生了LOH，提示NAH病變可能為HCC的一種癌前病變；
　　3、DLC-1蛋白在HCC組織中的表達水平顯著