大腸桿菌f2噬菌體多克隆抗體的研制及應用.pdf

1、大腸桿菌f2 噬菌體是一種RNA 病毒，其有些特性與腸道病毒極為相似，能像糞大腸菌群那樣在人和動物的腸道中存在，且其在水中的存活時間、對氯消毒的抵抗力也與脊髓灰質炎病毒相近。因此，國內外研究人員認為，大腸桿菌f2 噬菌體是一種比較理想的水中腸道病毒污染的指示物，并將它廣泛用于飲用水消毒效果評價，污水與環(huán)境水體中腸道病毒濃度、存活狀況評估，環(huán)境監(jiān)測方法與技術研究等方面。傳統(tǒng)的f2 噬菌體檢測方法有濁度比色、空斑實驗等，后者既可定性也可定量

2、，是一種常用的實驗方法。但是，它需要培養(yǎng)宿主菌和嚴格的無菌操作等繁瑣過程。尋找更加簡單、快捷、經濟、可靠的f2 噬菌體檢測方法，是研究者不懈努力的方向。大量研究資料表明，能夠滿足上述檢測要求的可行方法，有免疫層析、ELISA等免疫學方法。但是到目前為止，針對f2 噬菌體相關報道幾乎未見。因此，本研究嘗試制備兔抗f2 噬菌體多克隆抗體，以摸索出一條制備其抗體的方法和途徑，為相關的單克隆抗體制備及f2噬菌體的檢測研究提供最基礎的實驗素材。F

3、2 噬菌體為不含包膜的病毒顆粒，核衣殼表面含有豐富的抗原決定簇，用它免疫動物，不同的抗原決定簇能刺激不同的淋巴細胞而產生針對不同決定簇的抗體。通過篩選可以獲得具有高親和力多克隆抗體。 本研究以大腸桿菌f2 噬菌體為免疫原，以日本大白兔為受試動物，采用皮下多點注射的方式制備多克隆抗體，并通過純化，獲得了高濃度、高效價的兔抗f2 噬菌體IgG。初步探討了將多克隆抗體與微磁珠結合，濃集、分離水中大腸桿菌f2 噬菌體的過程，為水中病毒檢

4、測提供相關參考數(shù)據(jù)。 第一部分大腸桿菌f2 噬菌體多克隆抗體的研制 目的：制備大腸桿菌f2 噬菌體多克隆抗體，分離純化抗體。 方法：增殖f2 噬菌體，利用超速離心的方法純化f2 噬菌體，選擇3 只8周齡純種大白兔，采用皮下注射法，多次多點注射純化的大腸桿菌f 噬菌體，用血清中和試驗與間接ELISA 法檢測抗血清效價，當效價在1:3200 以上時從主動脈收集血液。分離血清，用飽和硫酸銨、離子交換層析法(DEAE-纖維

5、素，DE52)進一步純化，得到IgG；并通過紫外分光光度計掃描測定純化的IgG 濃度。 結果：受試動物經過全程免疫，獲得高效價多克隆抗血清，血清中和試驗效價大于1：16000，間接ELISA 檢測效價達到1：5000。結合離子交換層析和飽和硫酸銨純化獲得高濃度、高效價的IgG；經過血清中和試驗與間接ELISA 檢測純化后的抗血清IgG效價沒有降低，保留了較好的活力；利用紫外分光光度計掃描測定的IgG 濃度達到23.11mg/ml

6、，滿足了后續(xù)試驗的基本要求。 結論：成功制備兔抗f2噬菌體多克隆抗體并純化為IgG，抗體具有較好的效價和特異性，為進一步開展對大腸桿菌f2噬菌體的檢測研究提供了重要技術支持。 第二部分構建免疫磁珠濃集分離水中大腸桿菌f2 噬菌體 目的：構建免疫磁珠，為檢測水中f2 噬菌體及相關研究提供一種新的濃集、分離水中病毒的方法。 方法：將兔抗f2 噬菌體IgG 與微磁珠化學偶聯(lián)構建免疫磁珠，吸附水中f2 噬菌體，磁

7、性分離免疫磁珠-噬菌體復合物，然后洗脫免疫磁珠結合的噬菌體，空斑實驗檢測f2 噬菌體。改變洗脫液pH，觀察不同pH 對免疫磁珠捕獲病毒洗脫效果的影響。 結果：通過化學偶聯(lián)方法將抗體包被到磁珠上效果良好，免疫磁珠對f2 噬菌體的吸附效率約50％以上，但洗脫效率存在差異，約30％的f2 噬菌體可從免疫磁珠上洗脫下來；不同pH 值洗脫液洗脫效果不一樣，在pH 值接近2.7時效果較好。 結論：本實驗通過化學偶聯(lián)法成功構建免疫磁珠