腸出血性大腸桿菌O157：H7 TccP蛋白表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備和應(yīng)用研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7是一種重要的傳染性病原菌。自1975年首次被分離以來，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC O157：H7感染可致腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。EHEC O157的感染因具有暴發(fā)流行趨勢(shì)、強(qiáng)烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險(xiǎn)性等特點(diǎn)，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。目前對(duì)其感染仍缺乏有效的防治方

2、法，研究證明抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Stx)從而使患者并發(fā)HUS的危險(xiǎn)性增加，因此進(jìn)一步研究其致病機(jī)制以尋找新的有效的防治方法具有重要義。 病原體和宿主的相互作用是決定感染及發(fā)病的關(guān)鍵。EHEC與宿主腸道粘膜上皮細(xì)胞的粘附是疾病發(fā)展的第一步。介導(dǎo)O157細(xì)菌粘附定植的主要結(jié)構(gòu)單元是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)。該菌通過TTSS將其轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體(Tir)和Tir-細(xì)胞骨架偶聯(lián)蛋白(TccP)等效應(yīng)毒力分子轉(zhuǎn)運(yùn)至

3、宿主細(xì)胞，經(jīng)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)過程介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的“粘附與擦拭”(A/E)損傷。TccP是最近發(fā)現(xiàn)并確定的一種新的O157：H7毒力因子，是O157轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的效應(yīng)分子中與宿主細(xì)胞分子N-WiskottAldrich綜合癥蛋白(N-WASP)相互作用的終端效應(yīng)分子，由O157：H7基因組內(nèi)編號(hào)為Z3072的開放閱讀框序列編碼，是一個(gè)富含脯氨酸的蛋白，為O157粘附宿主細(xì)胞、形成肌動(dòng)蛋白踏板、造成A/E損傷所必需。本課題采用基因工程的方

4、法對(duì)腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7 TccP蛋白進(jìn)行了克隆表達(dá)、純化，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上制備了高滴度和高特異性的兔抗TccP多克隆抗體并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。首先選擇EHEC O157：H7 Sakai菌株基因組為模板，采用PCR及序列測(cè)定等方法獲得EHEC O157：H7 tccP DNA，克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；對(duì)在C末端融合了6his純化標(biāo)簽的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行

5、Westem blotting法分析；使用Ni<'2+>-NTA離子換樹脂進(jìn)行蛋白純化；純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE純度分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-tccP；Westem blotting結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中表達(dá)了分子量為37kD左右的目的蛋白；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni<'2+>-NTA離子交換樹脂純化，TccP-6his融合蛋白純度為95％以上。 以純化TccP-6his融合蛋白免疫新

6、西蘭大白兔，成功制備了有較高滴度和特異性的兔抗TccP多克隆抗體。以所獲特異性多克隆抗體作為一抗，使用雙向免疫擴(kuò)散、ELISA、Western blotting和免疫熒光等方法檢測(cè)標(biāo)本中TccP蛋白。結(jié)果顯示：免疫擴(kuò)散檢測(cè)可見兔抗TccP多克隆抗體稀釋度為1∶32時(shí)，仍呈現(xiàn)明顯沉淀線；ELISA檢測(cè)結(jié)果抗體滴度為1∶640 000；Western blotting檢測(cè)表明：用兔抗TccP多克隆抗體與TccP抗原進(jìn)行免疫印跡，在分子量約3

7、7kD處有一特異性條帶，與陽性對(duì)照純化TccP-6his融合蛋白相一致；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示，在被O157細(xì)菌粘附的HeLa細(xì)胞部位可見綠色熒光，其分布與細(xì)菌粘附的部位一致。提示：所制備的兔抗TccP多克隆抗體與粘附至HeLa細(xì)胞的O157細(xì)菌發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，重組的TccP表現(xiàn)有與天然細(xì)菌分泌的TccP相同的免疫原性。 在本課題實(shí)驗(yàn)研究中，從EHEC O157:H7 Sakai菌株的基因組中克隆得到了O157 tecPDNA序

8、列，該序列與GenBank報(bào)道的序列完全一致；所構(gòu)建的TccP原核表達(dá)載體在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，經(jīng)純化后得到了高純度TccP-6his融合蛋白。以傳統(tǒng)的多克隆抗體技術(shù)制備了兔抗TccP多克隆抗體。該多克隆抗體可用于對(duì)EHECO157：H7中TccP蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)，適用于雙向免疫擴(kuò)散、ELISA、Westem blotting和免疫熒光等多種常規(guī)檢測(cè)方法。利用掃描電鏡觀察了O157體外粘附細(xì)胞模型，結(jié)果顯示O157與HeLa細(xì)胞

9、緊密粘附，呈典型的局灶性粘附(LA)。使用兔抗TccP多克隆抗體對(duì)EHECO157：H7粘附宿主細(xì)胞模型內(nèi)的TccP蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究，結(jié)果直觀地顯示了TccP被聚集在宿主細(xì)胞被EHEC O157：H7粘附處細(xì)胞膜的下方。tccP基因的克隆表達(dá)、純化，TccP蛋白的獲得以及特異性兔抗TccP多克隆抗體的制備及應(yīng)用成功，為后續(xù)進(jìn)一步研究TccP在O157致病機(jī)制中的作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)未見類似研究報(bào)道，故本研究具有一定的創(chuàng)