深低溫冷凍時(shí)間對(duì)同種異體氣管移植免疫抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、臨床上多種原因可導(dǎo)致氣管狹窄，切除病變氣管行氣管端端吻合術(shù)是最理想的方法。但是氣管長(zhǎng)距離大范圍缺損無(wú)法行端端吻合，就需要采用氣管重建的方法。氣管移植被認(rèn)為是氣管重建的首選方法，但同種或異種氣管移植在應(yīng)用于臨床之前面臨著諸多需要解決的問(wèn)題，如供體氣管的儲(chǔ)存、移植后免疫排斥反應(yīng)的控制及氣管軟骨再生等。既往抑制免疫排斥反應(yīng)的主要手段是應(yīng)用免疫抑制劑，但是氣管腫瘤病人明顯不適用此種方法。由于導(dǎo)致氣管狹窄的原因當(dāng)中腫瘤是第一位的，所以尋求其他可以

2、抑制移植后免疫排斥反應(yīng)方法是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。在研究中發(fā)現(xiàn)，降低移植物抗原性可采用冷凍法和去上皮細(xì)胞法，其中深低溫冷凍法最為常用。冷凍后的組織既可以保持其原有的活性和組織完整性，又能削減其免疫原性，這樣既解決了供體的保存問(wèn)題，又解決了移植后免疫排斥反應(yīng)的控制問(wèn)題。但冷凍時(shí)間的長(zhǎng)短是直接影響移植氣管是否成功的關(guān)鍵之一，過(guò)長(zhǎng)將會(huì)降低移植物生存力，過(guò)短則達(dá)不到降低免疫排斥反應(yīng)的目的。合適冷凍時(shí)間的選擇成為解決深低溫冷凍氣管移植成功的關(guān)鍵之一。

3、
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究在深低溫(-80℃)條件下，對(duì)大鼠氣管移植體不同的冷凍保存時(shí)間后再移植到受體后的大體及病理改變，進(jìn)一步了解不同深低溫冷凍時(shí)間對(duì)大鼠氣管移植體各組織活性及免疫原性的影響（對(duì)氣管移植體的上皮、單核細(xì)胞的影響），探討同種異體大鼠氣管移植的可行性及所需凍儲(chǔ)的最短時(shí)間，為今后深低溫冷凍氣管移植的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：切取SD大鼠氣管段后分別移入注滿冷凍保護(hù)液的凍儲(chǔ)管(2ml)中，放置于4℃

4、冰箱中平衡4小時(shí)，采用程控降溫儀程序降溫，降溫速率1℃/分，降至-80℃迅速投入液氮中保存。冷凍保存后，取出凍儲(chǔ)管置于37℃恒溫水浴箱中，輕輕搖動(dòng)，使氣管段均勻快速解凍復(fù)溫。Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，分別將冷凍10天，20天，30天后的SD大鼠5個(gè)氣管軟骨環(huán)作為供體氣管移植體，行同種異體異位移植，包埋于Wistar大鼠腹腔大網(wǎng)膜內(nèi)。于術(shù)后4周取出氣管移植體，行大體及HE染色相關(guān)病理病理學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組CD3陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)

5、的情況。
　　 按冷凍時(shí)間不同分為冷凍組與對(duì)照組（F組），其中冷凍10天組為C1組，冷凍20天組為C2組，冷凍30天組為C3組。
　　 組織病理采用石蠟切片HE染色觀察；免疫組化采用SP法.應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1、我們采用石蠟切片HE染色方法對(duì)氣管移植組織病理進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：SD大鼠冷凍組氣管移植體管腔通暢度優(yōu)于未冷凍組；冷凍組各組氣管移植體與未冷凍組（對(duì)照組）氣

6、管移植體相比外觀顏色略顯蒼白。在移植之前冷凍組的上皮細(xì)胞數(shù)纖毛缺失，正常的假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮已經(jīng)被鱗狀上皮所取代，氣管腺幾乎失。移植4周后發(fā)現(xiàn)氣管體內(nèi)表面少量上皮覆蓋，其中少量為鱗狀上皮。F組與C1組移植4周后氣管內(nèi)可見(jiàn)纖毛上皮脫落明顯，主要為鱗狀上皮覆蓋，氣管腺幾乎消失。各組氣管環(huán)間、纖維外膜層及粘膜下層可見(jiàn)新生毛細(xì)血管生成，C2組和C3組毛細(xì)血管管腔通暢，而F組和C1組可見(jiàn)少量新生毛細(xì)血管內(nèi)有血栓生成。
　　 2、我們應(yīng)用免

7、疫組織化學(xué)方法，分析未冷凍及冷凍組CD3陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)，根據(jù)改良的Shimizu方法著色程度積分觀察各組分別為：在F組，其陽(yáng)性表達(dá)共8例，其中強(qiáng)陽(yáng)性6例，陽(yáng)性1例，弱陽(yáng)性1例；在C1組，其陽(yáng)性表達(dá)共8例，其中強(qiáng)陽(yáng)性6例，陽(yáng)性1例，弱陽(yáng)性1例，陰性0例：在C2組，其陽(yáng)性表達(dá)共8例，其中強(qiáng)陽(yáng)性2例，陽(yáng)性3例，弱陽(yáng)性3例，陰性0例；在C3組，其陽(yáng)性表達(dá)共3例，其中強(qiáng)陽(yáng)性1例，陽(yáng)性1例，弱陽(yáng)性1例，陰性5例；結(jié)果顯示，CD陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)在C1組與

8、F組相比差異不顯著(P＞0.05)，在C2組、C3組表達(dá)顯著低于F組(P＜0.05)，C2組與C3組CD3陽(yáng)性表達(dá)存在顯著差異(P＜0.05)，且隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)逐漸遞減。
　　 結(jié)論：
　　 1深低溫冷凍可降低氣管移植體的抗原性，減輕移植后的免疫排斥反應(yīng)，異體異位移植后，氣管移植體管腔結(jié)構(gòu)保持良好，可長(zhǎng)期存活。
　　 2對(duì)各組氣管移植體行術(shù)后抗原性及再上皮綜合比較，深低溫冷凍異體異位移植的最佳冷凍時(shí)間