人臍帶間充質干細胞對ITP的免疫抑制作用.pdf

1、第一部分CD70基因啟動子區(qū)甲基化在ITP發(fā)病機制中的作用
　　 研究背景：CD70(TNFSF7)，是一種甲基化敏感的免疫相關基因，在一些自身免疫性疾病中常常處于低甲基化的狀態(tài)。
　　 目的：研究在免疫性血小板減少(ITP)病人中，CD70基因的甲基化狀態(tài)及與調(diào)節(jié)甲基化水平的相關基因表達的關系。
　　 方法：我們用實時熒光定量PCR方法及流式細胞儀檢測ITP病人和健康對照的CD4+T細胞中CD70基因mRNA和

2、蛋白水平的表達。用甲基化特異性高分辨率熔解(MS-HRM)的技術檢測CD70基因啟動子區(qū)甲基化水平。此外，CD4+T細胞中的三種DNA甲基轉移酶(DNMTs)及一種去甲基化酶(MBD2)的基因也通過實時定量PCR方法測定，以健康人CD4+T細胞作為對照。
　　 結果：結果顯示，CD70基因，DNMTI，DNMT3A，DNMT3B及MBD2基因的mRNA水平在ITP患者的外周CD4+T細胞比健康對照顯著增高。HRM方法測得ITP患

3、者的CD4+T細胞的CD70基因的啟動子區(qū)甲基化水平比健康對照要低(p=0.147)。CD70基因的轉錄水平與其甲基化水平呈負相關，但是與幾種DNMTs的表達水平卻是呈顯著的正相關。
　　 結論：由此我們可以得出結論，DNA甲基轉移酶DNMTs可能也有如同MBD2一樣有去甲基化的功能，增加DNA甲基轉移酶DNMTs和MBD2都能導致CD70的低甲基化及過表達，從而對ITP的發(fā)病起著重要的作用。
　　 第二部分CD70和C

4、Dlla在ITP發(fā)病機制中作用的研究
　　 研究背景：ITP是一種血小板減少的自身免疫性疾病。而細胞自身反應性發(fā)生的主要原因之一就是由于粘附分子的過表達而導致的。CD70和CDlla這兩種共刺激分子對T、B淋巴細胞的免疫功能很重要，CD70和CDlla分子的過表達還可以誘發(fā)很多自身免疫性疾病。
　　 目的：研究CD70與CDlla兩種免疫相關的共刺激分子對ITP發(fā)病機制的不同影響。
　　 方法：用real-tim

5、e PCR和流式細胞儀檢測ITP患者CD4+T細胞中CD70與CDlla mRNA與蛋白水平的表達變化，以健康人作對照。在培養(yǎng)的ITP患者和健康人外周血PBMC中分別加入anti-CDlla和anti-CD70單克隆抗體，設對照孔，一部分加入自體血小板共培養(yǎng)72小時后，用流式方法檢測CD4+T細胞，CD19+B細胞，CD8+T細胞及自體血小板的凋亡情況，并用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-4，IFN-γ以及血小板相關IgG表達，另

6、一部分培養(yǎng)細胞用real-time PCR檢測GATA-3和T-bet的mRNA表達變化。
　　 結果：ITP患者CD4+T細胞中CD70與CDlla mRNA的表達水平和細胞表面的CD70與CDlla的表達較健康對照顯著增高。加入anti-CDlla和anti-CD70抗體的ITP患者培養(yǎng)細胞中，CD4+T細胞，CD19+B細胞和CD8+T細胞的凋亡比不加抗體的對照顯著增多，而自體血小板凋亡數(shù)目明顯減少。特別是加入anti-C

7、Dlla抗體培養(yǎng)的細胞中，不僅CD19+B細胞幾乎全部凋亡，而且自體血小板凋亡比例也是最少的。但健康人各細胞及血小板凋亡差異并不顯著。細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ在空白對照的細胞中表達最高，加入anti-CDlla和anti-CD70抗體的細胞都顯著降低，加入anti-CDlla抗體的細胞中IL-4的表達顯著增高。IgG的表達在各實驗組中沒有顯著差異。GATA-3和T-bet的mRNA表達變化沒有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：以上結果說

8、明CD70與CDlla能促進CD4+T細胞，CD19+B細胞及CD8+T細胞的存活，從而也間接促進了自身抗血小板抗體的分泌。用anti-CDlla和anti-CD70單克隆抗體阻斷T細胞上的相關信號通路后，逆轉了ITP的Thl/Th2的極化狀態(tài)，極大地抑制了IFN-γ的分泌，特別是anti-CDlla，還能明顯促進了IL-4的分泌，而且誘使大量的B細胞死亡，直接影響了血小板相關抗體的產(chǎn)生。我們認為CD70與CDlla，特別是CDlla對

9、ITP的發(fā)病可能起著十分重要的作用。阻斷CDlla可能成為治療ITP的潛在途徑。
　　 第三部分Bmi-1對ITP病人的自身反應性CD4+T細胞存活的調(diào)節(jié)作用
　　 研究背景：在免疫性血小板減少癥(ITP)患者的自身反應性CD4+T細胞是呈快速的克隆性擴增，而且具有凋亡抗性，在血小板減少中起著持續(xù)性的作用。已有的研究證明Bmi-1對于記憶性CD4+T細胞和效應性CD8+T細胞的存活都是十分必要的。
　　 目的：由

10、于Bmi-1記憶性CD4+T細胞的存活和Th2細胞的增殖，我們假設Bmi-1可能在ITP患者的自身反應性CD4+T細胞克隆性擴增及Thl/Th2漂移的過程中起到作用。
　　 方法：我們用慢病毒載體包裝成含有Bmi-1編碼序列及shBmi-1干擾片段的成熟病毒顆粒，再分別感染ITP患者及健康對照的CD4+T細胞后，用BrdU及Annexin V對細胞染色后用流式細胞術檢測在血小板刺激下的感染過或沒感染病毒的CD4+T細胞增殖及凋亡

11、情況。用ELISA方法檢測細胞因子分泌的變化。
　　 結果：我們的研究顯示急性ITP患者的CD4+T細胞比緩解期的病人及健康對照有較高的Bmi-1表達水平。自身反應性CD4+T細胞相比健康對照有更強的增殖能力和抗凋亡能力。在感染包裝好的慢病毒后，結果顯示用短的發(fā)卡RNA抑制Bmi-1的表達后，可以導致ITP患者的自身反應性CD4+T細胞增殖抑制而增加凋亡；同時，增加健康對照的CD4+T細胞的Bmi-1的表達可以促進CD4+T細胞

12、的增殖并抑制凋亡。Bmi-1能促進CD4+T細胞分泌IL-4。
　　 結論：這些結果說明Bmi-1對于ITP患者的自身反應性CD4+T細胞的克隆性擴增能力及抗凋亡能力的增強起到重要作用。
　　 第四部分人臍帶間充質干細胞對ITP的免疫抑制作用
　　 研究背景：入臍帶間充質干細胞(hUC-MSC)已經(jīng)在治療很多人類的炎癥性疾病和自身免疫性疾病中顯現(xiàn)出了顯著的效果，主要是基于其較低的免疫原性和免疫抑制的潛能。但是在U

13、C-MSC治療免疫性血小板減少癥(ITP)病人的療效方面還未見報道。
　　 目的：UC-MSC對ITP病人在體內(nèi)和體外免疫抑制效果的研究和評估。
　　 方法：我們將從ITP病人和健康對照的外周血單個核細胞(PBMCs)與骨髓單個核細胞(BM-MNCs)分別UC-MSC共培養(yǎng)3天和7天。應用流式細胞術和ELISA方法來檢測各項實驗參數(shù)。
　　 結果及結論：結果顯示在來自于ITP病人的PBMCs中，自身反應性T,B淋

14、巴細胞的增殖受到UC-MSC的明顯抑制，而與其自體血小板的破壞也得到明顯的緩解。UC-MSC不僅能抑制共刺激分子CD80，CD40和FasL在外周淋巴細胞表面的表達，而且還能改變Th1/Th2/Treg細胞因子的分泌特征。在ITP病人的骨髓單個核細胞中，UC-MSC可以顯著地逆轉巨核細胞異常的功能，能顯著促進血小板的生成，并減少存活巨核細胞的比例，但同時也能抑制巨核細胞的早期凋亡。另外，BM-MNCs分泌TPO的水平也顯著增高。我們的臨

15、床研究顯示UC-MSC能夠有效緩解難治性ITP患者出血癥狀并使血小板水平增高。這些體內(nèi)外結果說明UC-MSC細胞移植可能成為ITP的治療有效方法。
　　 第五部分異常信號通路導致的DNA低甲基化與自身免疫性疾病的關系
　　 DNA甲基化是基因組DNA一種主要的表觀遺傳修飾形式，主要在轉錄水平抑制基因的表達。異常的DNA低甲基化與人及小鼠的CD4+T細胞發(fā)生自身反應性有關聯(lián)，DNA甲基化水平低是由于DNA甲基轉移酶（DNM

16、T）的表達下降所致。而DNMT的表達受ERK信號轉導途徑的調(diào)控，ERK信號通路上游的蛋白激酶PKCδ的活化與否間接地影響到DNMT的表達，PKCδ磷酸化水平不足會導致ERK信號通路受損，最終下調(diào)DNMT的表達。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡這樣的自身免疫性疾病中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在CD4+T細胞中與免疫相關的甲基化敏感基因出現(xiàn)低甲基化及過度表達，主要包括黏附分子LFA-1和共刺激分子的受體CD70，CD40L等，這些分子過表達會使T細胞過度活化，并產(chǎn)生自身免疫