交感神經(jīng)遞質(zhì)對肝星狀細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制.pdf

1、本文應(yīng)用膽總管結(jié)扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，檢測腎上腺素受體各亞型的表達(dá)與肝纖維化發(fā)展的關(guān)系；進(jìn)一步在細(xì)胞水平分別給予去甲腎上腺素α受體及β受體的阻滯劑，檢測其對HSCs增殖、凋亡以及膠原代謝的作用，并探討交感神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控HSCs生物學(xué)行為的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，旨在闡明交感神經(jīng)系統(tǒng)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，從而尋求有效的預(yù)防和治療肝纖維化的新思路、新策略。實驗內(nèi)容主要包括以下四部分： 第一部分肝纖維化過程中去甲腎上腺

2、素各受體亞型表達(dá)的動態(tài)變化 目的：研究肝纖維化過程中去甲腎上腺素各受體亞型表達(dá)的動態(tài)變化。 方法：膽總管結(jié)扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，HE、Masson染色觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法檢測HSCs活化指標(biāo)α-SMA的表達(dá)，Western blot和Real-time Q-PCR檢測α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白和mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：①術(shù)后大鼠一般情況觀察：大鼠膽總管結(jié)扎后1 h～2 h

3、恢復(fù)活動，48 h左右尿液變黃，3～4天后皮膚毛發(fā)開始轉(zhuǎn)黃，精神逐漸變差，進(jìn)食量少于對照組，體重增加不明顯或稍有下降。5～6天一般狀況漸差，嗜睡，反應(yīng)遲緩，活動減少，黃疸明顯，鼠糞呈灰白色。20天后進(jìn)食量明顯減少，體重與對照組相比明顯降低，并且部分大鼠逐漸出現(xiàn)腹部隆起。②肝組織病理組織學(xué)變化：模型大鼠肝臟肉眼觀呈褐綠色或棕色，表面略呈細(xì)顆粒狀，質(zhì)地變硬。HE及Masson三色染色顯示，假手術(shù)對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊，肝細(xì)胞無腫

4、脹，無膽管增生，無淤膽及淋巴細(xì)胞浸潤，核仁清晰，少量結(jié)締組織局限于門管區(qū)。造模1 wk后，模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)散在變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤，部分區(qū)域出現(xiàn)小片狀壞死，門管區(qū)小膽管樣上皮細(xì)胞增生。造模2 wk后，模型組肝板正常排列消失，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，門管區(qū)小膽管廣泛增生，并向小葉內(nèi)延伸、肝小葉呈花環(huán)狀；新生小膽管周圍纖維組織增生，門管區(qū)面積擴(kuò)大，肝小葉內(nèi)亦有纖維組織增生。造模3 wk～4 wk后，模型組肝臟廣泛纖維結(jié)締組織增生，增生的纖維間隔互

5、相連接、包繞、分割，改建原來的肝小葉甚至形成假小葉。Masson三色染色膠原面積密度測定結(jié)果顯示：模型組1 wk、2 wk、3wk、4 wk膠原面積密度(10.11％±1.14％，21.14％±1.22％，28.87％±2.05％，37.44％±3.17％)均顯著高于假手術(shù)對照組(3.22％±0.77％)，P<0.01。③α-SMA免疫組織化學(xué)染色顯示：正常大鼠肝組織中僅在血管壁平滑肌細(xì)胞有弱陽性表達(dá)；隨著肝纖維化的發(fā)展，大鼠肝組織中α

6、-SMA陽性細(xì)胞明顯增多，主要分布于匯管區(qū)、纖維間隔、肝竇周圍及增生的膽管周圍細(xì)胞，造模1 wk～4 wk大鼠肝組織α-SMA的陽性面積(10.58％±1.75％，24.14％±2.02％，29.74％±2.59％，34.28％±2.01％)均顯著高于假手術(shù)組(4.12％±1.51％)，P<0.01。即肝纖維化程度越重α-SMA 染色陽性細(xì)胞數(shù)量亦越多。④Western blot檢測結(jié)果顯示，分別在大約57 kD、50 kD、47kD位

7、置出現(xiàn)α-AR、β1-AR、β2-AR特異性條帶，在43 kD位置可見β-actin條帶。假手術(shù)組有少量腎上腺素受體蛋白表達(dá)，隨著肝纖維化進(jìn)展其表達(dá)逐漸增加，造模1wk～4 wk大鼠肝組織α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白表達(dá)量明顯升高(1.54±0.08，1.87±0.15，2.72±0.09，2.84±0.18 vs 0.85±0.12，P<0.05；1.57±0.18，1.92±0.11，2.51±0.17，2.89±0.19

8、vs 0.98±0.15，P<0.05；1.84±0.20，1.97±0.09，2.85±0.14，3.87±0.1 8 vs 1.24±0.18，P<0.05)。⑤Real-time Q-PCR共擴(kuò)增檢測α-AR、β1-AR、β2-AR和內(nèi)參照GAPDH基因表達(dá)，根據(jù)：△c(t)實驗組=c(t)目的基因—c(t)GAPDH，Ac(t)對照組=c(t)目的基因—c(t)GAPDH，△△c(t)=△c(t)實驗組—△c(t)對照組，目的基

9、因的相對表達(dá)量folds=2-△△c(t)計算α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果證實，隨著肝纖維化的發(fā)展，α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)，造模4 wk表達(dá)最多(1.54±0.08，2.98±0.09，3.23±0.11，3.94±0.13 vs 1.00±0.07，P<0.01；1.47±0.10，2.13±0.09，2.54±0.12，2.81±0.10 vs 1.00±0.10，P<0

10、.01；1.24±O.07，2.78±0.10，3.54±0.14，4.24±0.15 vs 1.00±0.08，P<0.01)。⑥α-SMA與α-AR、β1-AR、β2-AR的多元相關(guān)分析顯示，α-SMA與α-AR、β1-AR及β2-AR呈正相關(guān)，r值分別為0.564、0.753和0.606。 結(jié)論：膽總管結(jié)扎法成功建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，肝纖維化形成過程中HSCs大量活化、增殖，α-SMA表達(dá)增加。隨著肝纖維化進(jìn)展，

11、α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白及mRNA含量明顯增加，與α-SMA呈明顯的正相關(guān)。 第二部分交感神經(jīng)遞質(zhì)NE對HSCs生物學(xué)行為的影響 目的：探討交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素對體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及膠原代謝的影響。 方法：體外培養(yǎng)HSCs，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測NE對HSCs增殖的影響；原位雜交凋亡檢測(TUNEL)法觀察NE對HSCs凋亡的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞凋亡調(diào)控基因b

12、cl-2和bax的蛋白表達(dá)情況；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；用Real-time Q-PCR檢測I型膠原mRNA的表達(dá)；并用Western blot和Real-time Q-PCR檢測MMP-13和TIMP-1蛋白和mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：交感神經(jīng)遞質(zhì)NE對體外活化的HSCs具有促進(jìn)增殖和抑制凋亡的作用，并引起凋亡調(diào)控基因bax表達(dá)下降，而bcl-2表達(dá)增加。NE還可以使HSCs MMP-13表達(dá)降低，TIMP-1表達(dá)升高

13、，進(jìn)而降低MMP-13/TIMP-1比值，從而減少其對肝臟膠原降解的作用，使HSCs Ⅰ型膠原表達(dá)量增加，從而加速肝纖維化的進(jìn)展。 第三部分去甲腎上腺素各受體亞型對HSCs生物學(xué)行為的調(diào)控作用 目的：探討交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素各受體亞型對肝星狀細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 方法：體外培養(yǎng)HSCs，Western blot檢測HSCs腎上腺素受體(α-AR、β1-AR及β2-AR)蛋白的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測腎上腺素

14、受體亞型在HSCs的分布與定位；Real-time Q-PCR檢測HSCs腎上腺素受體α-AR、β1-AR及β2-AR)mRNA的表達(dá)。細(xì)胞干預(yù)分為以下6組：①空白對照組，為單純HSCs培養(yǎng)；②交感興奮組(NE)；③α-AR阻滯組(酚妥拉明)；④β1-AR阻滯組(CGP20712A)；⑤β2-AR阻滯組(ICI118551)；⑥交感抑制組(酚妥拉明+普萘洛爾)。MTT法測定細(xì)胞增殖；TUNEL法觀察HSCs凋亡狀況；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋

15、亡率及凋亡調(diào)控基因bax和bcl-2的變化；Real-time Q-PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)；并用Western blot和Real-time Q-PCR檢測MMP-13和TIMP-1蛋白和mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：HSCs可以表達(dá)α-AR、β1-AR和β2-AR腎上腺素受體蛋白和mRNA，主要分布于HSCs的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。α-AR、β1-AR和β2-AR特異性阻滯劑均可以抑制HSCs增殖、誘導(dǎo)其凋亡。并可以拮抗NE引起

16、的凋亡基因的變化，使bax表達(dá)下降，bcl-2表達(dá)升高。其中，α-AR阻滯劑酚妥拉明和β2-AR阻滯劑ICI118551效果最明顯。NE受體阻滯劑促進(jìn)HSCs MMP-13表達(dá)，顯著降低TIMP-1表達(dá)，MMP-13/TIMP-1比值回升；Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)亦明顯降低。 第四部分 NE調(diào)控HSCs生物學(xué)行為的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 目的：探討交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素對肝星狀細(xì)胞生物學(xué)行為影響的信號傳導(dǎo)機(jī)制。 方法：體外培

17、養(yǎng)HSCs，加入PI-3K信號通路抑制劑LY294002，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測NE對HSCs增殖的影響；TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡情況；Western blot檢測PI-3K蛋白表達(dá)的變化情況。 結(jié)果：①NE促進(jìn)HSCs增殖，加入PI-3K信號通路抑制劑LY294002后細(xì)胞增殖受抑制；②NE作用于HSCs 24 h，TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)均證實HSCs凋亡率顯著低于對照組，加入PI-3K信號通路抑制劑LY2