ARHI基因對骨肉瘤細胞生物學行為的影響及其相關機制研究.pdf

1、骨肉瘤(Oseteosarcoma)亦稱為成骨肉瘤，是一種常見于兒童和青少年時期的惡性原發(fā)性骨腫瘤。早期即可發(fā)生廣泛的肺轉移，死亡率高，是導致兒童和青少年死亡的最常見的疾病之一。其總體發(fā)病率各國統(tǒng)計數(shù)字差異較大，約1/10萬~0.1/10萬。盡管當前新的輔助化療及手術技術有了進一步的發(fā)展和提高，骨肉瘤患者的生存率也因此顯著提高了，但仍有部分患者會出現(xiàn)化療效果差，容易復發(fā)和轉移的情況。近年來，隨著分子生物學研究和技術的不斷發(fā)展，骨肉瘤的最

2、新研究已進入基因治療、靶向治療階段，從分子水平研究腫瘤中相關基因的表達對腫瘤的發(fā)生、演變、轉歸及治療具有重要意義。目前在腫瘤生物基因靶向治療及信號轉導通路作用機制的研究方面出現(xiàn)了許多新的進展，這為我們對骨肉瘤的預防和治療提供了新的方法和途徑。ARHI(aplasia ras homologue member I)，是一個母源性印記基因。它又被稱為DiRas3或NOEY2，于1999年被首次發(fā)現(xiàn)。近年來研究表明，其編碼蛋白在人類的胰腺、乳

3、腺、卵巢等多個組織中存在著不同的表達。但是，它在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤中則表現(xiàn)為表達缺失或下調(diào)，提示ARHI基因與上述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關性。ARHI基因作為一個抑癌基因，其在調(diào)控腫瘤細胞的生長增殖、侵襲遷移以及誘導細胞凋亡、干預細胞信號轉導通路等方面扮演著重要角色。ARHI作為一種新的研究目的基因，為腫瘤的分子水平基因治療探索提供了新的思路。ARHI基因在腫瘤中的應用研究尚處于初始階段，迄今在國內(nèi)外的研究領

4、域尚無關于骨肉瘤中ARHI基因的表達和ARHI基因對骨肉瘤生物學特性影響及相關機制研究的文獻報道。鑒于上述原因，本實驗將通過構建目的基因ARHI穩(wěn)定表達的骨肉瘤MG-63、U2OS和SAOS-2細胞系，對ARHI基因在骨肉瘤細胞中的表達情況作以研究，并以此為依據(jù)，深入探討ARHI基因對骨肉瘤生物學特性的影響及其作用機制，以期為骨肉瘤的基因診斷及治療提供更多理論支撐和依據(jù)。本研究分為四個部分：
　　第一部分：ARHI基因在人骨肉瘤細

5、胞及正常成骨細胞中的表達及意義。
　　目的：研究ARHI基因在人骨肉瘤細胞及正常成骨細胞中的表達情況，探討ARHI基因在人骨肉瘤中表達的生物學意義。
　　方法：分為3種人骨肉瘤細胞系(MG-63、U2OS、SAOS-2)和人正常成骨細胞hFOB1.19，采用RT-PCR和Western blot法分別檢測ARHI基因mRNA和蛋白的表達情況，對結果進行統(tǒng)計分析，揭示在正常的成骨細胞中是否存在ARHI基因的表達以及其在人骨肉瘤

6、細胞中表達的變化情況。
　　結果：⑴應用RT-PCR和Western blot法分別檢測了骨肉瘤細胞系中ARHI基因mRNA及蛋白表達情況，結果顯示其內(nèi)均存有不同程度ARHI基因表達。⑵RT-PCR顯示骨肉瘤細胞系中ARHI mRNA表達水平低于正常成骨細胞，以MG-63細胞下降最為顯著，表達水平有顯著性差異（P<0.05）。⑶Western blot法檢測結果：骨肉瘤細胞系中ARHI蛋白表達水平低于正常成骨細胞，以MG-63細胞

7、下降最為顯著，表達水平有顯著性差異（P<0.05）。
　　結論：ARHI基因在骨肉瘤細胞系中普遍低表達，提示其表達可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，影響骨肉瘤的生物學行為。
　　第二部分：ARHI基因轉染骨肉瘤細胞陽性克隆穩(wěn)定株的構建及鑒定。
　　目的：構建穩(wěn)定表達目的基因ARHI的骨肉瘤細胞系模型并進行鑒定，為研究ARHI基因對骨肉瘤細胞生物學行為的影響奠定基礎。
　　方法：應用基因克隆技術，構建真核表達載體pc

8、DNA3.1-ARHI（攜帶目的基因ARHI基因編碼序列），將ARHI基因重組質(zhì)粒pcDNA3.l-ARHI和空載體質(zhì)粒pcDNA-3.1分別經(jīng)轉化大腸桿菌、質(zhì)粒提取擴增和純化鑒定后，采用脂質(zhì)體法分別瞬時轉染骨肉瘤細胞系MG-63、U2OS、SAOS-2，通過G418篩選，建立穩(wěn)定轉染ARHI基因的骨肉瘤細胞系模型。擴增培養(yǎng)后應用RT-PCR及Western blot法分別檢測骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2細胞轉染前后目的基因

9、ARHI在 mRNA和蛋白表達水平的變化。
　　結果：⑴真核表達質(zhì)粒pcDNA3.l-ARHI轉染骨肉瘤細胞系和空載體pcDNA3.l轉染骨肉瘤細胞系均獲得新霉素抗性，通過G418篩選，建立了穩(wěn)定轉染ARHI基因的骨肉瘤細胞系。⑵通過RT-PCR、Western blot法檢測顯示重組質(zhì)粒pcDNA3.l-ARHI轉染骨肉瘤細胞系后，目的基因ARHI在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達均較空載體組和未轉染組有顯著增高（P<0.05），而

10、空載體組和未轉染組的ARHI表達則沒有明顯不同（P>0.05）。
　　結論：應用基因克隆技術在體外成功構建能夠穩(wěn)定表達目的基因ARHI的骨肉瘤細胞系。
　　第三部分：ARHI基因調(diào)控骨肉瘤細胞增殖、凋亡、侵襲遷移的體外研究。
　　目的：研究目的基因ARHI對骨肉瘤細胞增殖、凋亡及侵襲遷移的影響，證實其在骨肉瘤中的生物學作用。
　　方法：以成功構建的分別能穩(wěn)定表達外源 pcDNA3.1-ARHI、空載體pcDNA3

11、.1的骨肉瘤細胞系和未轉染的骨肉瘤細胞系為研究對象。通過生長曲線和MTT法分析ARHI基因對骨肉瘤細胞增殖的影響；流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測ARHI基因對骨肉瘤細胞凋亡的影響；通過Transwell小室侵襲實驗和Transwell小室遷移實驗研究ARHI基因對骨肉瘤細胞侵襲遷移的影響。
　　結果：⑴從骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2細胞的生長曲線數(shù)據(jù)分析。ARHI組細胞生長速度要比空載體組明顯

12、減慢，ARHI基因抑制了骨肉瘤細胞的生長，尤其在72~96h，與空載體組比較，具有明顯的差異性（P<0.05）。⑵應用MTT法檢測細胞生長，可見ARHI組細胞生長明顯減慢，對MG-63、U2OS和SAOS-2細胞均有明顯的生長抑制作用，ARHI組與空載體組比較，具有明顯的差異性（P<0.05）。⑶Annexin V-FITC/PI雙染色后用流式細胞儀檢測骨肉瘤細胞凋亡情況，定量分析骨肉瘤MG-63細胞的凋亡率，結果發(fā)現(xiàn)ARHI組MG-6

13、3凋亡細胞的百分率為29.7％，空載體組為4.31%。與空載體組比較，ARHI基因明顯增加了細胞凋亡百分率（P>0.05）。⑷通過Transwell侵襲實驗可以觀察到MG-63細胞在ARHI組較空載體組細胞侵襲能力明顯下降（P<0.05）；通過Transwell遷移實驗可以觀察到MG-63細胞在ARHI組較空載體組細胞遷移能力明顯下降（P<0.05）。
　　結論：①ARHI基因抑制骨肉瘤細胞的增殖；②ARHI基因誘導骨肉瘤細胞發(fā)生

14、凋亡；③ARHI基因抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移；④ARHI基因在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中是一個抑癌基因。
　　第四部分：小干擾RNA對骨肉瘤細胞ARHI基因、蛋白表達及細胞增殖、凋亡的影響以及ARHI基因對PI3K/Akt信號通路的影響。
　　目的：研究小干擾RNA對骨肉瘤MG-63細胞ARHI基因的表達水平及細胞增殖、凋亡的影響；研究ARHI基因對PI3K/Akt信號通路和Caspase凋亡信號通路的影響。
　　方法：使

15、用化學合成法構建針對ARHI的小干擾RNA，通過使用dharmafect4轉染試劑將其轉染入ARHI高表達的骨肉瘤MG-63細胞。通過RT-PCR、Western blot方法、MTT增殖實驗及流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測其對ARHI基因、蛋白表達水平及細胞增殖、凋亡的影響；通過Western blot方法檢測ARHI基因對PI3K/Akt信號轉導通路中p-Akt和Akt蛋白表達的作用；通過Caspase-G

16、lo?3/7試驗檢測ARHI基因對Caspase-3活性的影響。
　　結果：⑴成功構建了針對ARHI基因的小干擾RNA；⑵通過RT-PCR檢測顯示，ARHI siRNA轉染MG-63細胞48h后，與control siRNA轉染組比較。ARHI siRNA轉染組細胞中ARHI mRNA的表達水平下降約92%，具有明顯差異性（P<0.05）；⑶通過Western blot方法檢測顯示，與control siRNA轉染組比較，ARHI

17、 siRNA轉染組MG-63細胞中ARHI蛋白表達水平下調(diào)，具有明顯差異性（P<0.05）；⑷應用MTT比色法檢測顯示，ARHI siRNA轉染組細胞增殖較control siRNA轉染組有所增加，具有明顯差異性（P<0.05）；⑸流式細胞儀檢測顯示，ARHI siRNA轉染48h后MG-63細胞的凋亡率4.8%，明顯低于control siRNA轉染組31.1%，具有顯著差異性（P<0.05）；⑹在ARHI基因轉染MG-63細胞72h

18、后，觀察p-Akt蛋白的表達，結果顯示骨肉瘤細胞轉染ARHI基因后，與空載體比較，發(fā)現(xiàn)磷酸化的p-Akt蛋白表達明顯下調(diào)，而通過RNAi技術使ARHI基因沉默則顯著上調(diào)了p-Akt蛋白表達，然而control siRNA轉染組p-Akt蛋白表達無明顯改變；⑺Caspase-Glo?3/7試驗檢測ARHI基因轉染組與ARHI基因沉默組細胞中Caspase-3活性均較對照組無顯著改變（P>0.05）。
　　結論：①成功地合成了ARHI