利用安培法實(shí)時(shí)記錄心交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放及遞質(zhì)釋放機(jī)制的研究.pdf

1、目的和方法:心臟受交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)雙重支配，在生理狀態(tài)下二者的張力保持動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)心臟電生理和泵功能發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用。自主神經(jīng)特別是交感神經(jīng)分布和功能紊亂可能導(dǎo)致心律失常。因此，對(duì)交感神經(jīng)傳出沖動(dòng)和遞質(zhì)釋放活動(dòng)及其調(diào)控機(jī)制的研究一直是心臟學(xué)領(lǐng)域的重要課題。本實(shí)驗(yàn)首次采用恒壓安培法在組織切片水平和整體水平對(duì)心交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放進(jìn)行了實(shí)時(shí)記錄，并對(duì)遞質(zhì)釋放的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討。 主要結(jié)果如下： 1.恒壓安培法實(shí)時(shí)記錄心交感

2、神經(jīng)遞質(zhì)釋放技術(shù)可靠性的鑒定。在心室活組織切片上，給予80mM的高鉀刺激可得到與刺激時(shí)程相當(dāng)?shù)恼蜓趸娏鳎粚⑿氖仪衅美?0.1mg/ml)孵育15分鐘后再給予高鉀刺激，得到的氧化電流信號(hào)變小，因而推測(cè)該電流信號(hào)為交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多引起；單獨(dú)給予腎上腺素α<,2>受體阻滯劑育亨賓(yohimbine)也可引起類似的電流；給予含育亨賓的80mM高鉀引起的電流顯著大于單獨(dú)給予高鉀刺激所引發(fā)的電流強(qiáng)度(8.75±3.3pA vs 17

3、.29±8.50 pA)，符合由α<,2>受體介導(dǎo)的去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)釋放的負(fù)反饋抑制機(jī)制。根據(jù)心臟分泌的在該條件下可能被氧化的物質(zhì)種類和已有NE釋放的文獻(xiàn)報(bào)道，我們初步斷定檢測(cè)到的氧化電流主要由NE氧化所形成，但也不排除少量未知成分。在兔在體心臟實(shí)驗(yàn)部分，窒息或氮?dú)馕胍部梢鹫蜓趸娏鳎恢苯与姶碳ば菭钌窠?jīng)節(jié)，在心室部位同樣記錄到了類似的氧化電流。至此我們已經(jīng)完全肯定用恒壓安培法可以實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地記錄心

4、交感神經(jīng)遞質(zhì)NE的釋放。 2.金纖微電極在記錄NE釋放的同時(shí)還可檢測(cè)到心電信號(hào)。在體心臟研究部分采用改良的聚丙烯金纖微電極記錄，該電極除了克服玻璃碳纖微電極易斷的缺點(diǎn)外，還具有雙重記錄功能，可同時(shí)記錄到相對(duì)緩慢的遞質(zhì)氧化信號(hào)和快速的心電信號(hào)，這是本工作附帶的意外發(fā)現(xiàn)。利用該技術(shù)所記錄到的心電信號(hào)，我們得以發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)的負(fù)性變時(shí)作用強(qiáng)于交感神經(jīng)的正性變時(shí)作用。以20Hz、10mA持續(xù)10秒的方波刺激左側(cè)頸迷走神經(jīng)，心率由對(duì)照情況

5、的263.5次/分減少至115次/分；而以20Hz、30mA持續(xù)10秒的方波刺激左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)，盡管有NE釋放的增加，心率只是增加到265.5次/分(n=9)。以5-30Hz(40～50Hz的刺激引起心跳驟停)方波電刺激左或右側(cè)迷走神經(jīng)時(shí)，隨著刺激頻率的增大，心率減慢的幅度也逐漸增加；在5～20Hz的范圍內(nèi)，左、右迷走神經(jīng)激活所引起的心率減慢幅度大致相當(dāng)；頻率在30Hz時(shí)，刺激右側(cè)迷走神經(jīng)使心率由268次/分降到36次/分，減慢幅度為2

6、32次/分，顯著高于刺激左側(cè)迷走神經(jīng)所引發(fā)的心率減慢幅度183次/分(n=4，p<0.05)。這些結(jié)果提示左右迷走神經(jīng)功能的不對(duì)稱性。 3.心交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)控機(jī)制的分析。我們發(fā)現(xiàn)，在體心臟上不同基礎(chǔ)狀態(tài)下刺激迷走神經(jīng)所引起的交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放變化方向不同。預(yù)先反復(fù)刺激星狀神經(jīng)節(jié)再刺激迷走神經(jīng)，記錄信號(hào)為負(fù)向電流，說明NE釋放減少；但如果直接刺激迷走神經(jīng)則可以得到正向氧化電流，說明NE釋放增多，提示迷走神經(jīng)在不同的交感張力情況

7、下對(duì)NE的釋放發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。在心室活組織切片上，乙酰甲膽堿(M型受體激動(dòng)劑，methacholine，Mctl)和谷氨酸(glutamate，Glu)短時(shí)刺激均可引起心交感神經(jīng)NE釋放的增加；在無鈣溶液情況下心交感神經(jīng)NE的釋放信號(hào)小于含鈣溶液孵育時(shí)的信號(hào)，說明無鈣液時(shí)NE的釋放降低。以含鈣液洗脫交換無鈣液后，NE的釋放可以恢復(fù)到原先的水平，提示心交感神經(jīng)NE的釋放過程有鈣參與。 結(jié)論：1.本研究首次用恒壓安培法在心室活組

8、織切片和在位心臟上成功記錄到心交感神經(jīng)遞質(zhì)NE的釋放，該技術(shù)穩(wěn)定、可靠，具有較高的時(shí)間分辨率和空間分辨率。2.細(xì)胞外高鉀、窒息、氮?dú)馕胄匀毖跫爸苯蛹せ钚菭钌窠?jīng)節(jié)均可引起心交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多。 3.利用該技術(shù)再次證明了α<,2>腎上腺素受體介導(dǎo)NE釋放的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的存在。4.在體心臟情況下，迷走神經(jīng)對(duì)心交感神經(jīng)遞質(zhì)的釋放具有雙向調(diào)節(jié)作用：交感張力高(預(yù)先反復(fù)電刺激星狀神經(jīng)節(jié))時(shí)，刺激迷走神經(jīng)可抑制NE的釋放；而交感張力低(不刺激星

9、狀神經(jīng)節(jié))時(shí)，刺激迷走神經(jīng)增強(qiáng)NE的釋放。但在離體心片，低濃度到高濃度(0.01，0.1，lM)擬迷走神經(jīng)遞質(zhì)乙酰甲膽堿(Methacholine，Mch)均易化NE的釋放，提示迷走和交感在中樞甚或外周的相互作用對(duì)自主神經(jīng)傳出活動(dòng)的影響。5.谷氨酸可能對(duì)心交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放有一定調(diào)節(jié)作用。6．心交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程有鈣參與，但可能并不完全依賴于鈣。7．交感神經(jīng)的正性變時(shí)作用可能弱于迷走神經(jīng)的負(fù)性變時(shí)作用。8．迷走神經(jīng)的負(fù)性變時(shí)作用在5～3