組胺作為一種交感神經(jīng)遞質(zhì)的新證據(jù).pdf

1、背景與目的: 組胺（Histamine, HA）是人體內(nèi)重要的自體活性物質(zhì)，具有廣泛的生理作用，同時也參與介導多種疾病的病理生理過程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，存在完整的HA 能神經(jīng)體系，HA 作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)參與介導認知記憶、睡眠覺醒、飲水攝食等功能。在外周組織中，HA 主要以肥大細胞源和非肥大細胞源兩種形式貯存。肥大細胞來源的HA 參與介導變態(tài)反應的病理過程，非肥大細胞源性HA 的生理和病理作用尚不十分清楚。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，非肥大細胞來源的

2、HA 存在于大鼠外周胃腸道的神經(jīng)、頸上神經(jīng)節(jié)（Superior cervical ganglion,SCG）、頸動脈體感覺神經(jīng)元等，提示HA 可能與這些神經(jīng)元的活動有關。 我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，在豚鼠SCG 的神經(jīng)元內(nèi)，參與合成HA 的組胺酸脫羧酶（Histidine decarboxylase, HDC）與合成去甲腎上腺素（Norepinephrine,NE）的酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）和

3、多巴胺β羥化酶（Dobamine-β-hydroxylase, DβH）共存，而且HA 和NE 也共存其中；刺激交感神經(jīng)末梢能使HA 和NE 從交感神經(jīng)末梢共釋放；激動交感神經(jīng)末梢突觸前膜HA H3 受體能夠負反饋調(diào)控HA 和NE 的釋放。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們首先提出HA 很可能是一種尚未被認識的新的交感神經(jīng)遞質(zhì)，并提出HA 參與負反饋調(diào)控交感神經(jīng)傳遞的假說。然而HA 與NE 在交感神經(jīng)元內(nèi)的共存是否具有普遍性？HA 在交感神經(jīng)元內(nèi)的

4、亞細胞定位如何？ HA 從交感神經(jīng)元內(nèi)釋放是否遵循經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)囊泡釋放的規(guī)律？這些都是為最終定義HA 作為一種新的交感神經(jīng)遞質(zhì)所必須回答的問題。 基于以上問題，本研究采用免疫熒光多重標記、順行示蹤及激光共聚焦顯微鏡技術，觀察HA 在不同種屬動物交感神經(jīng)節(jié)與交感神經(jīng)末梢的分布，及其與NE 的共存；采用包埋前免疫電鏡技術觀察HA 在交感神經(jīng)末梢和培養(yǎng)交感神經(jīng)節(jié)細胞的亞細胞定位；在新生豚鼠原代培養(yǎng)SCG 細胞上，利用FM1

5、-43 熒光染料研究HA 突觸囊泡釋放、運動的循環(huán)動力學，為最終證實HA 是一種新的交感神經(jīng)遞質(zhì)提供新證據(jù)。開展這一領域的研究對于揭示交感神經(jīng)的新功能，深入認識交感神經(jīng)功能紊亂疾病相關疾病的發(fā)病機理，尋找新的具有潛在治療可能性的藥物新靶點等都具有重要的理論意義。 結(jié)果: 1. 組胺和NE 在不同動物交感神經(jīng)系統(tǒng)的共存分布本研究采用免疫熒光雙標和激光共聚焦顯微鏡技術，發(fā)現(xiàn)在小鼠SCG、狗SCG 和腹腔交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)，

6、以及小鼠和豚鼠輸精管、腸系膜動脈的交感神經(jīng)神經(jīng)末梢中均有HA 和NE 共存。在小鼠和狗的SCG 中，NE樣免疫陽性神經(jīng)元中HA 的雙標率分別為70％ 和40％，狗腹腔節(jié)中NE 樣免疫陽性神經(jīng)元中HA 的雙標率為60％。在小鼠和豚鼠的輸精管、腸系膜動脈標本上，NE 樣免疫陽性神經(jīng)纖維中HA 的雙標率分別為80％ 和30％。在豚鼠SCG 局部微量注射順行示蹤劑生物素化葡聚糖胺（Biotinylateddextranamine, BDA），取

7、豚鼠心臟標本，采用免疫熒光三重標記技術觀察自SCG 投射到心臟的交感神經(jīng)纖維和末梢中HA。結(jié)果顯示，BDA 順行示蹤投射到心臟的交感神經(jīng)纖維中，20％ 的示蹤神經(jīng)纖維呈HA 樣免疫陽性反應，10％ 示蹤神經(jīng)纖維呈現(xiàn)HA 和NE 樣免疫陽性反應。上述結(jié)果在細胞水平確定HA 廣泛分布于不同種屬動物的交感神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，并與NE 共存，為定義HA 作為新的交感神經(jīng)遞質(zhì)提供了直接的形態(tài)學證據(jù)。 2. 組胺在交感神經(jīng)末梢及培養(yǎng)SCG 神經(jīng)元

8、中的亞細胞定位在支配豚鼠輸精管交感神經(jīng)末梢內(nèi)，以及原代培養(yǎng)的豚鼠SCG 神經(jīng)元內(nèi)，利用HA 包埋前免疫電鏡技術，電鏡觀察顯示，HA 樣免疫陽性物質(zhì)定位于直徑約50 nm 的小囊泡內(nèi)，且HA 陽性囊泡約占囊泡總數(shù)的90％ 以上，大囊泡（直徑＞100 nm）及個別小囊泡無HA 免疫陽性物質(zhì)。結(jié)果表明，交感神經(jīng)元內(nèi)HA 主要存在于小囊泡中，本項結(jié)果在亞細胞水平為定義HA作為新的交感神經(jīng)遞質(zhì)提供了直接的形態(tài)學證據(jù)。 3. 培養(yǎng)SCG

9、神經(jīng)突起部位組胺突觸囊泡循環(huán)動力學利用FM1-43 熒光染料，結(jié)合HA 免疫熒光染色，在培養(yǎng)豚鼠SCG 神經(jīng)元突起上觀察HA 囊泡的釋放動力學和HA 囊泡的運動過程，激光共聚焦顯微鏡成像并統(tǒng)計分析結(jié)果。脫色（Destaining）研究結(jié)果顯示，SCG 神經(jīng)突起中HA 的紅色熒光信號強度與FM1-43 綠色熒光信號強度隨除極刺激作用時間的增加，而呈現(xiàn)同時逐漸減弱的現(xiàn)象，兩者呈顯著正相關（r =0.989, P < 0.01），表明HA 的

10、釋放遵循囊泡釋放動力學的普遍規(guī)律。在除極作用的不同時間點固定細胞，分別測定代表HA 的紅色熒光強度和代表FM1-43 的綠色熒光強度，結(jié)果表明HA 的紅色熒光強度要強于FM1-43 的綠色熒光強度。由于在本研究采用的除極條件下，F(xiàn)M1-43 熒光信號主要反映循環(huán)囊泡的釋放情況，HA 與FM1-43 的熒光強度出現(xiàn)差異的結(jié)果提示，在神經(jīng)突起部位貯存HA 的囊泡可能存在可釋放囊泡庫和儲備囊泡庫之分。 熒光漂白恢復（Fluoresc

11、ence recovery after photobleaching, FRAP）結(jié)合免疫組織化學研究結(jié)果顯示，在SCG 神經(jīng)突起處含有HA 囊泡的擴散速度為0.09μm2/s，其他囊泡為0.08 μm2/s。HA 囊泡的運動過程與其他囊泡無顯著性差異。 結(jié)論： 1. HA 普遍存在于多種動物的交感神經(jīng)系統(tǒng)，并與經(jīng)典交感神經(jīng)遞質(zhì)NE共存。 2. HA 主要貯存于交感神經(jīng)突觸小囊泡內(nèi)。 3. 交感神經(jīng)