miRNA干擾FASN表達對骨肉瘤細胞生物學行為影響的體外研究.pdf

1、目的:
　　構建和篩選沉默F(xiàn)ASN基因的最佳重組質粒，探討下調FASN基因表達對人骨肉瘤細胞U2-OS細胞體外增殖、侵襲、遷移能力的影響。
　　方法:
　?、俑鶕?jù)NCBI查詢到的FASN cDNA序列設計并合成靶向FASN的寡聚核苷酸序列，連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體中構建重組質粒(分別命名為X197-1、2、3、4)。重組質粒與脂質體2000共轉染人骨肉瘤U2-OS細胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀

2、察熒光率。RT-PCR和Western blot檢測構建的重組質粒對FASN的mRNA及蛋白表達的影響。
　　②優(yōu)化的質粒轉染條件，以優(yōu)化轉染條件((plasmid: Lipofectamine2000=1∶3))轉染人骨肉瘤細胞U2-OS，MTT法檢測細胞增殖變化，劃痕愈合和Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲、遷徙能力。
　　結果:
　?、俪晒嫿ㄙ|粒，其中質粒(X197-1、X197-2)轉染U2-OS骨肉瘤細

3、胞的熒光率大于50％。四質粒均能有效抑制FASN mRNA(53.2±4％、47.5±3％、41.9±5％、52.8±2)％及FASN蛋白的表達(抑制率:79.4％、47.3％、64.5％、64.2％)。同其他質粒相比，X197-1被篩為最佳質粒。
　?、贛TT法檢測轉染X197-1質粒的細胞在24h、48h、72h、96h的OD值分別為（0.1183±0.0408、0.1567±0.0476、0.3033±0.0121、0.47

4、83±0.0107），明顯低于陰性對照組和空白組(p＜0.05)。劃痕愈合實驗結果示轉染X197-1質粒的細胞遷移率(13.7±8.7％)明顯低于陰性對照組(74.8±4.5％)和空白組(77.6±6.4％)(p＜0.05)。Transwell侵實驗結果顯示轉染X197-1質粒的細胞穿膜數(shù)（55±4.8）個明顯少于少于陰性對照質粒組(135±7.4)個和空白組(146±6.7)個(p＜0.05)。這些數(shù)據(jù)表明構建的干擾質粒沉默F(xiàn)ASN基